楊穎，厲舒禎，范書伶，楊婧，李政，張珩琳，曲媛媛

大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024

目前，關(guān)于納米硒在抗癌、抗氧化、抗菌等醫(yī)學(xué)方面的相關(guān)應(yīng)用已有不少報(bào)道。對(duì)于納米硒的合成而言，生物法因成本低廉、無(wú)毒、環(huán)保等特點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注[1]。在合成納米硒的眾多生物資源中，細(xì)菌是一種高效的綠色納米合成工廠，大量文獻(xiàn)報(bào)道不同種類的細(xì)菌能夠合成尺寸與形態(tài)各異的納米硒顆粒。例如，生枝動(dòng)膠菌Zooglea ramigera和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis均可在體外合成尺寸均一、分散性良好的球形納米硒顆粒[2-3]。貪酮桿菌Cupriavidus metalliduransCH34可在細(xì)胞內(nèi)將亞硒酸鹽還原為單質(zhì)納米硒，且其胞內(nèi)含有大量重金屬抗性基因[4]。然而，目前關(guān)于菌株胞外合成納米硒的研究仍未見報(bào)道。與胞內(nèi)合成納米硒相比，胞外合成反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、不需要繁瑣的后續(xù)操作，如細(xì)胞破碎以及溶劑萃取分離產(chǎn)物等，具有更廣泛的應(yīng)用前景[5]。

此外，關(guān)于納米硒在生物醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用也有很多。Khiralla等研究發(fā)現(xiàn)用菌株嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaSeITE02合成的納米硒顆粒對(duì)大腸桿菌具有良好的抗菌活性，也有文獻(xiàn)表明該菌株無(wú)法合成具有良好抗菌活性的納米硒顆粒，但其合成的納米硒顆粒生物相容性較好[6-7]。通常納米硒顆粒的形貌不同對(duì)其性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定的影響。Urarika等通過(guò)分子設(shè)計(jì)和合成的方式成功合成出尺寸為300 nm的立方體結(jié)構(gòu)的單質(zhì)納米硒顆粒，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該種形貌的納米硒相較于球形顆粒而言對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗癌能力[8]。而迄今為止，如何利用生物法定向合成特定形貌或尺寸的納米硒顆粒仍是目前的研究難點(diǎn)，有待于進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

本研究選擇前期篩選的貪銅桿菌Cupriavidussp. SHE，分別探究其細(xì)胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細(xì)胞合成納米硒的能力，并對(duì)細(xì)胞上清液合成的生物納米硒顆粒進(jìn)行形貌及尺寸表征分析。通過(guò)考察生物轉(zhuǎn)化合成納米硒過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)生物納米硒的合成機(jī)理進(jìn)行初步探索。最后利用大腸桿菌Escherichia coliBL21和假單胞菌Pseudomonassp. PI1考察合成的納米硒顆粒的抗菌特性。

1 材料與方法

1.1 菌株

貪銅桿菌Cupriavidussp. SHE分離自大連理工大學(xué)牛角山泥土樣品，現(xiàn)已鑒定并保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No.9266菌株Cupriavidussp. SHE的16S rRNA基因序列儲(chǔ)存于 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，保存號(hào)為KJ875863。菌株Cupriavidussp. SHE采用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分為：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L[9]。

1.2 主要試劑

二氧化硒 (SeO2)，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所；氯化鈉 (NaCl)，購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；菌株Escherichia coliBL21為實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的工程菌，菌株P(guān)seudomonassp.PI1為實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選得到。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純及以上。

1.3 利用菌株Cupriavidus sp. SHE細(xì)胞上清液、全細(xì)胞和胞內(nèi)提取物合成納米硒

從土壤中分離的菌株Cupriavidussp. SHE于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為150 r/min、30 ℃、24 h。菌株達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌液在10 000 r/min下離心10 min (Avanti-30型，美國(guó)E Beckman公司)[8]，用注射器將離心后的上清液透過(guò) 0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到細(xì)胞上清液。離心后的菌細(xì)胞用超純水沖洗3次，再利用超純水將其OD600調(diào)整為 1.0得到菌株的全細(xì)胞溶液。將離心后得到的菌細(xì)胞用超純水清洗3次后用一定量的超純水重懸，然后利用超聲破碎儀 (超聲波處理器CPX 750、美國(guó)) 破碎30 min，將破碎后的體系在10 000 r/min條件下離心10 min，離心后得到的上清液用 0.45 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到菌株Cupriavidussp. SHE的胞內(nèi)提取液。最后將上述3種反應(yīng)體系分別與 5 mmol/L SeO2在 30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)，合成納米硒顆粒。

1.4 納米硒的表征

首先通過(guò)溶液顏色變化直接觀察納米硒的生成，然后在400–800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外分光光度計(jì) (UV-vis，Metash UV-9000，中國(guó)) 對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)量，考察其納米硒的合成情況。用透射電子顯微鏡 (TEM，F(xiàn)EI Tecnai G2 Spirit，荷蘭)對(duì)菌株Cupriavidussp. SHE的細(xì)胞上清液合成的納米硒顆粒的大小及形貌進(jìn)行表征分析，用X射線衍射 (XRD，Rigaku，日本) 對(duì)菌株Cupriavidussp. SHE的細(xì)胞上清液合成的納米硒晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析，用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜 (FTIR，IRPrestige-21，Japan) 在 400–4 000 cm–1范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系中可能參與納米硒生物合成的物質(zhì)的官能團(tuán)進(jìn)行表征分析。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分析生物合成的納米硒

為了研究可能參與納米硒還原和穩(wěn)定的蛋白，采用 SDS-PAGE進(jìn)行分析[10]。將菌株Cupriavidussp. SHE在10 000 r/min下離心30 min，收集合成的含有結(jié)合蛋白的納米硒，然后用超純水洗滌 3次，再懸浮于超純水中，最后利用SDS-PAGE對(duì)納米硒表面附著的蛋白進(jìn)行分析。

1.6 納米硒的抗菌活性

本實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法對(duì)納米硒的抗菌活性進(jìn)行初步的考察，實(shí)驗(yàn)選取革蘭氏陽(yáng)性菌Pseudomonassp. PI1和革蘭氏陰性菌E. coliBL21進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。首先在瓊脂平板 (MHA) 上分別接種上述兩種菌液 200 μL (1.5×108CFU/mL)，用無(wú)菌棒涂勻。將濾紙剪成直徑為10 mm的圓盤狀，取25 μL納米硒滴在剪好的濾紙上，然后用無(wú)菌鉗把濾紙放在瓊脂板上，以滅菌超純水為對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h后，通過(guò)觀察在紙片周圍是否存在抑菌圈以及抑菌圈直徑的大小來(lái)判斷納米硒顆粒對(duì)兩株常見致病菌的抗菌性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Cupriavidus sp. SHE合成納米硒的能力

本實(shí)驗(yàn)利用菌株Cupriavidussp. SHE的細(xì)胞上清液、胞內(nèi)提取物和全細(xì)胞3個(gè)反應(yīng)體系分別與SeO2作用，合成納米硒顆粒。反應(yīng)數(shù)天后，3個(gè)反應(yīng)體系中均可觀察到體系顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)槌燃t色，細(xì)胞上清液和胞內(nèi)提取物體系在7 d內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，全細(xì)胞體系在10 d內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定。使用UV-vis分析表明，如圖1所示，3個(gè)反應(yīng)體系在600 nm處出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰，證明反應(yīng)體系中有納米硒的生成[11]。用Bradford試劑盒測(cè)試蛋白質(zhì)濃度顯示，細(xì)胞上清液中的蛋白濃度(25 mg/L) 遠(yuǎn)低于胞內(nèi)提取物 (150 mg/L)，但實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象卻表明細(xì)胞上清液具有更強(qiáng)的納米硒合成能力[12]。因此，推測(cè)菌株Cupriavidussp. SHE能分泌某些生物活性分子，例如谷胱甘肽 (glutathione，GSH) 等，能在胞外作為還原劑還原Se (IV) 為單質(zhì)納米硒顆粒[10]。有研究表明，α、β和γ變形菌門的菌株能夠在胞外分泌較高濃度的谷胱甘肽參與亞硒酸的還原和納米硒的生成[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，菌株Cupriavidussp. SHE屬于β變形菌門，在細(xì)胞上清液中可能存在大量的谷胱甘肽類物質(zhì)，因此我們可以在未來(lái)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的考察研究。

圖1 不同反應(yīng)體系下菌株Cupriavidus sp. SHE (A)全細(xì)胞、(B) 胞內(nèi)提取物以及 (C) 細(xì)胞上清液合成納米硒的UV-vis光譜圖Fig. 1 UV-vis spectra of SeNPs synthesized by (A) the cells, (B) cell extracts and (C) cell-free supernatant of strain SHE. The insets show the color of SeNPs before and after reaction. Reaction condition: pH 7, 5 mmol/L SeO2.

隨后考察不同SeO2濃度及不同溶液pH對(duì)菌株Cupriavidussp. SHE細(xì)胞上清液合成納米硒的影響。SeO2濃度對(duì)生物合成納米硒的影響如圖2A所示。當(dāng)SeO2濃度在1–5 mmol/L時(shí)，隨著SeO2濃度的增大，其在UV-vis圖中的特征吸收峰峰值逐漸增加，但當(dāng)SeO2濃度進(jìn)一步增大至7 mmol/L及以上時(shí)，其特征吸收峰峰值明顯下降。相關(guān)文獻(xiàn)表明反應(yīng)體系中納米硒的濃度與其在UV-vis中的特征吸收峰峰值呈正相關(guān)關(guān)系[12]，因此菌株Cupriavidussp. SHE的細(xì)胞上清液合成納米硒的最佳SeO2濃度為5 mmol/L。由于反應(yīng)體系pH值的不同會(huì)影響到細(xì)胞提取物中酶的活性，進(jìn)而會(huì)對(duì)納米硒的合成造成一定的影響，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了6個(gè)不同的pH梯度，分別考察了細(xì)胞上清液在酸性、中性以及堿性條件下合成納米硒的情況。其UV-vis結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系pH值為5和10時(shí)，UV-vis圖中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，表明此時(shí)反應(yīng)體系中沒(méi)有納米硒的產(chǎn)生，當(dāng)反應(yīng)體系pH為7時(shí)，其特征吸收峰值達(dá)到最大，因此，pH為7是菌株Cupriavidussp.SHE上清液合成納米硒的最佳條件。

2.2 生物合成納米硒的表征

我們采用TEM觀察菌株Cupriavidussp. SHE上清液合成的納米硒顆粒的形貌和尺寸分布，如圖3所示。生物合成的納米硒顆粒主要為球形，少數(shù)為棒狀，且具有良好的分散性。進(jìn)一步利用粒徑分析軟件Nano Measurer 1.2對(duì)合成的納米硒顆粒粒徑進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的納米硒尺寸粒徑分布在83–480 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為196 nm。有研究表明菌株嗜堿假單胞菌Pseudomonas alcaliphila和菌株Zooglea ramigera合成的納米硒顆粒的形貌在一定環(huán)境因素作用下會(huì)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為棒狀顆粒[2]。推測(cè)可能是因?yàn)榇蟪叽缜蛐渭{米硒顆粒的自由能遠(yuǎn)高于三角形或棒狀納米硒顆粒而導(dǎo)致自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所以球形納米硒顆粒在反應(yīng)體系中能自發(fā)溶解形成小尺寸的硒原子，而較小尺寸的硒原子可再次組裝形成一定尺寸的棒狀納米硒顆粒，降低了自身的自由能提高了穩(wěn)定性[2]。

圖2 不同SeO2濃度 (A) 以及pH (B) 條件下菌株Cupriavidus sp. SHE細(xì)胞上清液合成納米硒的UV-vis圖Fig. 2 Uv-vis diagram of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE SHE with cell supernatant under different SeO2 concentration (A) and pH (B) conditions.

圖3 菌株Cupriavidus sp. SHE細(xì)胞上清液合成納米硒的TEM圖Fig. 3 TEM images of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE with cell supernatant. (A) Spherical SeNPs. (B)Rod-like SeNPs. (C) Size distribution diagram.

對(duì)合成的納米硒顆粒進(jìn)行XRD表征分析，結(jié)果如圖 4所示。與納米硒顆粒的六方型標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS No. 06-0362) 對(duì)比可知，2θ在 23.74o、30.50o、42.16o、44.32o、46.81o、52.84o以及 62.30o處出現(xiàn)7個(gè)明顯的衍射峰，分別與六方晶型結(jié)構(gòu)的 (100)、(101)、(110)、(102)、(111)、(201)、(202)晶面相對(duì)應(yīng)[9]，并且 (101) 面的衍射峰強(qiáng)度明顯高于其他峰，由此可說(shuō)明合成的納米硒晶體顆粒以 (101) 面為主導(dǎo)。

圖4 菌株Cupriavidus sp. SHE細(xì)胞上清液合成納米硒的XRD圖Fig. 4 XRD image of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE.

圖5 菌株Cupriavidus sp. SHE細(xì)胞上清液及其合成的納米硒的FTIR圖Fig. 5 FTIR image of the cell-free supernatant of strain SHE and the biogenic SeNPs.

為了對(duì)生物合成納米硒的機(jī)制進(jìn)行初步的探索，我們對(duì)合成的納米硒顆粒進(jìn)行FTIR表征分析，結(jié)果如圖5所示。其中，3 430、1 454和1 050 cm-1處的特征吸收峰分別對(duì)應(yīng)-N-H、-COO和C-N的拉伸振動(dòng)峰，1 652、1 542和1 245 cm-1處的特征吸收峰對(duì)應(yīng)氨基I、II和III的特征吸收峰[14-15]，表明一些蛋白質(zhì)可能參與了納米硒的合成或穩(wěn)定過(guò)程。例如，有研究表明陶厄式菌Thauera selenatis能在胞外分泌一種蛋白Sefa，該蛋白是一種良好的封端劑，能有效防止合成的納米硒顆粒相互聚集[16]。同樣地，用生枝動(dòng)膠菌Z. ramigera和大腸桿菌E. coli合成的納米硒顆粒表面也可能存在著一些蛋白類物質(zhì)，對(duì)納米硒的合成和穩(wěn)定過(guò)程起著重要的作用[2,17]。綜上，我們推測(cè)在生物合成的納米硒表面通常會(huì)覆蓋一層蛋白類物質(zhì)，它們的存在能促進(jìn)納米硒的還原也防止了小尺寸納米硒顆粒的聚集，從而使合成的納米硒顆粒尺寸更為均一，分散性更為良好。

SDS-PAGE分析表明 (圖 6)，在凝膠上出現(xiàn)多條不同大小分子量的條帶，且隨著樣品體積量的增加，條帶的顏色加深，由此可說(shuō)明在合成的納米硒顆粒的表面附著了一層蛋白質(zhì)物質(zhì)。Malhotra等發(fā)現(xiàn)某些小分子蛋白可以較為容易地通過(guò)質(zhì)膜排到培養(yǎng)基上清液中，與金屬離子反應(yīng)生成納米顆粒[18]。因此，我們推測(cè)在SDS-PAGE中分離的蛋白質(zhì)物質(zhì)也在納米硒的合成和穩(wěn)定過(guò)程中起到了重要的作用。

2.3 納米硒的抗菌活性

圖6 SeNPs表面蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of proteins bound to biosynthesized SeNPs. Lane M: standard protein molecular weight marker; lane 1: 5 μL bound proteins;lane 2: 10 μL bound proteins.

圖7 生物合成的納米硒對(duì)E. coli BL21 (A) 和Pseudomonas sp. PI1 (B) 的抗菌活性Fig. 7 The antimicrobial activities of biosynthesized SeNPs against E. coli BL21 (A) and Pseudomonas sp. PI1 (B).

最后，我們利用菌株P(guān)seudomonassp. PI1和E. coliBL21對(duì)本實(shí)驗(yàn)中合成的納米硒顆粒的抗菌性進(jìn)行考察，如圖7所示，當(dāng)納米硒濃度為0.5–50 mg/mL時(shí)，平板中的小紙片周圍均未發(fā)現(xiàn)明顯的抑菌圈，由此可說(shuō)明用菌株Cupriavidussp.SHE細(xì)胞上清液合成的納米硒顆粒生物相容性較好。已有研究證實(shí)，用嗜麥芽窄食單胞菌S. maltophiliaSeITE02和地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的無(wú)細(xì)胞上清合成的納米硒顆粒對(duì)菌株E. coli具有較為明顯的抗菌活性[6,19]。然而，在考察菌株熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens和枝孢菌Cladosporiumsp. JAPSK3合成的納米硒顆粒的抗菌性時(shí)，得到的結(jié)果卻截然不同[7]。利用酸奶中的益生菌產(chǎn)生的納米硒已被證實(shí)是一種無(wú)毒、安全的食品添加劑[20]。目前有研究人員提出納米硒的抗菌性大小可能與納米硒的濃度以及顆粒大小有關(guān)，此外，納米硒顆粒的形貌以及其元素組成也會(huì)對(duì)其諸多物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響[6,19]。綜上，本研究利用菌株Cuprivadiussp. SHE細(xì)胞上清液獲得的納米硒無(wú)毒且生物相容性較好，因此該納米硒顆粒在生物醫(yī)學(xué)或食品工業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了菌株Cupriavidussp. SHE細(xì)胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細(xì)胞合成納米硒的能力，對(duì)其合成納米硒顆粒的形貌進(jìn)行表征，并通過(guò)分析納米硒表面關(guān)鍵蛋白初探合成機(jī)理，最后對(duì)生物合成納米硒的抗菌特性進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：(1) 在利用菌株Cupriavidussp. SHE的細(xì)胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細(xì)胞進(jìn)行納米硒合成過(guò)程中，通過(guò)UV-vis均發(fā)現(xiàn)在600 nm處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，表明3個(gè)反應(yīng)體系均具有生物合成納米硒的能力。(2) 菌株Cupriavidussp. SHE細(xì)胞上清液合成的納米硒的形貌主要為球形，少數(shù)為棒狀，且顆粒分散性良好，平均粒徑為196 nm；XRD分析表明合成的納米硒顆粒的晶體結(jié)構(gòu)為六方形結(jié)構(gòu)，并且以 (101) 面為主導(dǎo)。(3) 本實(shí)驗(yàn)利用FTIR和SDS-PAGE表征對(duì)納米硒生物合成的機(jī)理進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明覆蓋在納米硒顆粒表面的某些小分子蛋白可能參與了納米硒的合成及穩(wěn)定過(guò)程，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將引進(jìn)基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白組等組學(xué)技術(shù)對(duì)該過(guò)程中具體的分子機(jī)制或其中起關(guān)鍵作用的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的揭示。(4) 本實(shí)驗(yàn)表明菌株Cupriavidussp.SHE細(xì)胞上清液胞外合成的納米硒顆粒對(duì)E. coliBL21和Pseudomonassp. PI1均無(wú)抗菌活性，說(shuō)明菌株Cupriavidussp.SHE合成的納米硒顆粒無(wú)毒且生物相容性好。