張清，朱杉，崔乃香，張博聞，王志，陳曉斌，劉軍，李俊輝，蔡冬波，楊之帆，陳守文，馬昕

1 湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省環(huán)境微生物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430062

2 湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068

3 綠康生化股份有限公司，福建 浦城 353400

桿菌肽是一種由 12個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽類廣譜型抗生素，主要由地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌產(chǎn)生[1-2]，其組成氨基酸包含 Orn、D-Phe、His、D-Asp、Asn、Lys、D-Glu、Cys、Leu、Ile和 Val共 11種[1-4]。桿菌肽是由多種組分組成的混合物[3]，包括桿菌肽A、A1、B1、B2、B3、C、D……G等，其中A、B1、B2組分的生物活性約占其總生物活性的95%以上。桿菌肽由7個(gè)氨基酸組成的噻唑環(huán)組成，這種獨(dú)特的氨基酸結(jié)構(gòu)使得其不易被蛋白酶降解，且常以桿菌肽鋅鹽形式存在，因而在自然界中穩(wěn)定性較強(qiáng)[1]。桿菌肽絡(luò)合物可以與細(xì)菌細(xì)胞壁上的異戊烯焦磷酸結(jié)合[5]，進(jìn)而有效抑制細(xì)胞壁合成，因此對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌具有顯著抑制效果[5-6]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域[7-8]。目前，桿菌肽生產(chǎn)水平較低，搖瓶水平一般為700–800 U/mL，限制了桿菌肽的生產(chǎn)及應(yīng)用推廣。

與常規(guī)蛋白質(zhì)合成機(jī)制不同，桿菌肽是由非核糖體肽合成酶催化合成[9-11]。桿菌肽合成的前體氨基酸會(huì)與腺嘌呤核苷三磷酸 (Adenosine triphosphate，ATP) 結(jié)合，由該酶的 A結(jié)構(gòu)域催化生成活性氨酰-AMP，進(jìn)而生成桿菌肽。此外，ATP是細(xì)胞代謝通用的能量載體，在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物合成、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、酶活性調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮著不可或缺的作用[12-13]。目前，能量代謝工程育種也得到人們的廣泛關(guān)注。通過(guò)強(qiáng)化來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白VHb，人們顯著提高了芽胞桿菌中聚-γ谷氨酸[14]、透明質(zhì)酸[15]等產(chǎn)物的合成水平。鑒于芽胞桿菌高的維持代謝能[16]，優(yōu)化細(xì)胞呼吸鏈分支途徑也有利于細(xì)胞維持代謝能的降低，進(jìn)而有利于目的產(chǎn)物的合成。Nicola等[16]通過(guò)敲除枯草芽胞桿菌RB50中呼吸鏈終端細(xì)胞色素bd氧化酶，將維持代謝能降低了 40%，進(jìn)而提高了菌體生物量和核黃素產(chǎn)量。采用同樣策略，Liu等[17]和 Cai等[18]分別顯著提高了芽胞桿菌中 N-乙酰葡糖胺和聚-γ谷氨酸產(chǎn)量。Zhao等[19]通過(guò)優(yōu)化終端氧化酶表達(dá)水平，使得大腸桿菌中 β-胡蘿卜素產(chǎn)量提升21%。

地衣芽胞桿菌 DW2是一株桿菌肽工業(yè)生產(chǎn)菌株。之前的研究中，本課題組通過(guò)強(qiáng)化底物利用[15]、前體氨基酸 (鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、支鏈氨基酸等) 供給[20]、輔因子再生[12]等顯著提高了桿菌肽產(chǎn)量，但對(duì)于能量供給水平與桿菌肽合成的關(guān)系尚不明晰。本研究擬通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞呼吸鏈分支途徑、強(qiáng)化ATP合成途徑等能量代謝工程育種策略獲得桿菌肽高產(chǎn)地衣芽胞桿菌工程菌株，進(jìn)而提高桿菌肽生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究出發(fā)菌株為桿菌肽工業(yè)生產(chǎn)菌株地衣芽胞桿菌 DW2，其由綠康生化股份有限公司提供，菌株保藏號(hào)為CCTCC M2011344。本研究所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。相關(guān)引物見(jiàn)表2。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH為7.0–7.2。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉 10 g/L、瓊脂 18 g/L，pH 為 7.0–7.2。

桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉45 g/L、輕鈣6 g/L、硫酸銨1 g/L、豆粕100 g/L，自然pH。

1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek公司；ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于碧云天生物技術(shù)有限公司；引物合成及序列測(cè)定均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖購(gòu)自Spanish公司；α-淀粉酶、抗生素 (Amp、Kan、Tet) 購(gòu)自阿拉丁試劑 (上海) 有限公司；豆粕、玉米淀粉、輕鈣來(lái)源于綠康生化股份有限公司；其他普通試劑 (國(guó)產(chǎn)分析純) 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 地衣芽胞桿菌工程菌株構(gòu)建

1.4.1 地衣芽胞桿菌游離表達(dá)菌株構(gòu)建

地衣芽胞桿菌游離表達(dá)菌株DW2/pHY-qoxA、DW2/pHY-adk和DW2/pHY-dck的構(gòu)建方法，以DW2/pHY-qoxA為例。首先，以枯草芽胞桿菌 168基因組為模板，使用引物pHY-qoxA-1和pHY-qoxA-2，擴(kuò)增出P43強(qiáng)啟動(dòng)子。以地衣芽胞桿菌 DW2為模板，使用pHY-qoxA-3/4和pHY-qoxA-5/6分別擴(kuò)增出qoxA基因和amyL終止子。重疊延伸PCR連接啟動(dòng)子、qoxA基因和終止子 (pHY-dck-1/6)。隨后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/XbaⅠ酶切片段與質(zhì)粒pHY300PLK，經(jīng)酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到游離表達(dá)載體pHY-qoxA。隨后，pHY-qoxA經(jīng)電轉(zhuǎn)化至地衣芽胞桿菌 DW2中，篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即為游離表達(dá)菌株DW2/pHY-qoxA。采用同樣的方法，構(gòu)建獲得游離表達(dá)菌株DW2/pHY-dck和DW2/pHY-adk。

1.4.2 地衣芽胞桿菌基因敲除菌株構(gòu)建

地衣芽胞桿菌基因敲除菌株的構(gòu)建方法，以cydB缺失的地衣芽胞桿菌DW2ΔcydB構(gòu)建為例。以地衣芽胞桿菌 DW2為模板，使用引物cydB-KF1/KR1和 cydB-KF2/KR2分別擴(kuò)增cydB基因的上游和下游同源臂。重疊延伸PCR連接上下游同源臂。隨后，采用內(nèi)切酶SacⅠ/XbaⅠ酶切穿梭載體 T2(2)-Ori和上下游同源臂片段，經(jīng)酶連、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，驗(yàn)證并獲得敲除載體T2-ΔcydB。將該載體電轉(zhuǎn)化至地衣芽胞桿菌DW2中，經(jīng)單-雙交換，驗(yàn)證并獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到地衣芽胞桿菌cydB基因缺失菌株DW2ΔcydB。

1.4.3 地衣芽胞桿菌基因整合表達(dá)菌株構(gòu)建

地衣芽胞桿菌基因整合表達(dá)菌株的構(gòu)建方法可參照基因缺失菌株構(gòu)建流程：以基因qoxA整合表達(dá)菌株構(gòu)建為例，先以地衣芽胞桿菌 DW2為模板，分別擴(kuò)增出整合載體的上下游同源臂以及qoxA基因表達(dá)盒。重疊延伸PCR連接上述3個(gè)片段，后經(jīng)過(guò)酶切、酶連構(gòu)成整合表達(dá)載體T2-::qoxA。隨后，將整合表達(dá)載體T2-::qoxA電轉(zhuǎn)至地衣芽胞桿菌中，經(jīng)過(guò)單雙交換，驗(yàn)證并獲得地衣芽胞桿菌qoxA基因整合表達(dá)菌株。

表2 本研究所使用的引物Table 2 The primers used in this study

1.5 桿菌肽發(fā)酵

種子培養(yǎng)：將保存于超低溫冰箱中的菌株稀釋涂布于帶有相應(yīng)抗性的固體LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，隨后挑取單菌落重新活化于相應(yīng)抗性平板上。挑取平板上長(zhǎng)好的單菌落接種于含5 mL液體LB培養(yǎng)基的PA瓶中，230 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。再以5%接種量轉(zhuǎn)接到含20 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)6–7 h后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以 5%接種量接至含20 mL桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。隨后，測(cè)定發(fā)酵液 pH，pH到 8.0時(shí)即到發(fā)酵終點(diǎn)。發(fā)酵中每個(gè)菌株均設(shè)置3個(gè)平行。

1.6 分析方法

地衣芽胞桿菌生物量采用稀釋涂布法測(cè)定。桿菌肽效價(jià)檢測(cè)采用安捷倫 1260液相色譜儀完成，色譜柱型號(hào)：Eclipse Plus C18 column(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相甲醇∶乙腈∶鹽相為60.4 ∶ 4 .6 ∶ 3 5，進(jìn)樣體積為20 μL；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm。胞內(nèi)ATP濃度使用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定，ATP檢測(cè)的取樣點(diǎn)為24 h。

桿菌肽合成對(duì)數(shù)期 (30 h) 的氨基酸濃度使用安捷倫7890A氣相色譜儀測(cè)定。對(duì)于胞外氨基酸檢測(cè)的預(yù)處理：吸取2 mL發(fā)酵液于離心管中，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液過(guò)膜備用。對(duì)于胞內(nèi)氨基酸檢測(cè)的預(yù)處理：吸取15 mL發(fā)酵液于離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心10 min。吸取8 mL上清液與10 mL預(yù)冷2.5% (W/V) 氯化鈉迅速混勻，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清；沉淀用10 mL預(yù)冷2.5% (W/V) 碳酸銨溶液洗滌2次，最后用3 mL預(yù)冷80% (V/V) 甲醇溶液抽提5 min，上清液凍干后加蒸餾水溶解備用。

衍生化處理：取500 μL樣品，加入10 μL的7 mol/L氫氧化鈉溶液和500 μL無(wú)水乙醇與吡啶混合液 (體積比 4∶1)，振蕩混勻。加入 100 μL 氯甲酸乙酯后，超聲1 min，重復(fù)該操作一次；加入500 μL含1% ECF的氯仿溶液以及200 μL飽和碳酸氫鈉溶液，振蕩1 min后加入40 μL 1%乙酸苯乙酯?；旌衔镬o置5 min，隨后3 000 r/min離心5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移到含 0.1 g硫酸鈉的 EP管中。3 000 r/min離心5 min，取上清溶液轉(zhuǎn)移到氣相瓶中。

氣相色譜檢測(cè)：色譜柱型號(hào) Agilent HP-5 column (30 m×0.32 mm×0.25 μm)，檢測(cè)器溫度為280 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，氣體流速為1.5 mL/min?？諝狻錃?、氮?dú)饬魉俜謩e為 300 mL/min、30 mL/min、30 mL/min。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。采用Origin 8.5和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析(其中，*表示差異顯著 (P<0.05)，**表示差異極顯著 (P<0.01))。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因cydB缺失對(duì)桿菌肽合成的影響

之前研究報(bào)道指出，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌中均含有4種呼吸鏈末端氧化酶，分別為細(xì)胞色素caa3氧化酶 (ctaCDEF編碼)、細(xì)胞色素bd氧化酶 (cydABCD編碼)、細(xì)胞色素aa3氧化酶(qoxABCD編碼)、YthAB氧化酶 (ythAB編碼)[16-17]。其中細(xì)胞色素bd氧化酶較為特殊，該酶不含有轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的跨膜通道，每轉(zhuǎn)運(yùn)1個(gè)電子僅能向外轉(zhuǎn)移 1個(gè)質(zhì)子，H+/e–為1[21-22]。因此，這條分支途徑通常被認(rèn)為是能耗比較高的途徑(圖 1)。本研究中，我們通過(guò)構(gòu)建cydB基因敲除載體，得到了cydB基因缺失菌株 DW2ΔcydB。隨后，將DW2和DW2ΔcydB分別接種于LB培養(yǎng)基中，通過(guò)檢測(cè)二者生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，cydB缺失后細(xì)胞生長(zhǎng)速率快于野生菌 (圖 2A)。結(jié)合之前的文獻(xiàn)報(bào)道，說(shuō)明cydB缺失降低了菌體維持代謝能，有利于菌體生長(zhǎng)。

圖1 地衣芽胞桿菌DW2呼吸電子傳遞鏈Fig. 1 Respiratory electron transport chain of Bacillus licheniformis DW2.

隨后，將DW2和DW2ΔcydB分別接種于桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中。分別檢測(cè)其最高生物量、桿菌肽效價(jià)和胞內(nèi)ATP濃度。由圖2B可知，DW2最大生物量 (24 h) 為413.54×108CFU/mL，cydB缺失菌株生物量為 431.35×108CFU/mL，提高了4.31%。cydB缺失有利于桿菌肽合成，其桿菌肽最高效價(jià) (48 h) 提高了10.97%。DW2ΔcydB單位菌體桿菌肽效價(jià)為2.02×10–8U/CFU，相比于對(duì)照菌株 (1.90×10–8U/CFU)提高了 6.87%。此外，通過(guò)對(duì)二者胞內(nèi) ATP含量 (24 h) 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DW2ΔcydB中胞內(nèi)ATP濃度達(dá)到32.56 nmol/L，相比于對(duì)照菌株 (26.48 nmol/L) 提高了 22.96%(圖2C)。由此可見(jiàn)，缺失cydB可以提高胞內(nèi)ATP供給水平，進(jìn)而有利于桿菌肽高產(chǎn)。

2.2 強(qiáng)化表達(dá)qoxA基因?qū)U菌肽合成影響

之前的研究中，人們指出細(xì)胞色素bd氧化酶和aa3氧化酶是芽胞桿菌中主要的兩條呼吸鏈分支途徑。人們之前已證實(shí)細(xì)胞色素bd氧化酶途徑是能耗比較高的途徑，并通過(guò)缺失cydB提高了相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成水平[16-17,21]。然而，細(xì)胞色素aa3氧化酶與代謝產(chǎn)物合成的關(guān)系并未有人研究。本研究中，我們分別構(gòu)建了qoxA缺失及強(qiáng)化表達(dá)菌株DW2ΔqoxA和DW2/pHY-qoxA。

如圖3A所示，缺失qoxA基因后，細(xì)胞生物量有所降低，相比于對(duì)照菌株下降了11.46%。而強(qiáng)化表達(dá)qoxA則能夠顯著提高菌體生長(zhǎng)水平。隨后，將上述4種菌分別接種于桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，qoxA缺失菌株桿菌肽最高效價(jià) (48 h) 為693.24 U/mL，相比于對(duì)照降低了 11.61%，強(qiáng)化表達(dá)qoxA有利于桿菌肽合成，其桿菌肽效價(jià)相比于對(duì)照提高了18.27%，單位菌體桿菌肽效價(jià)提高了11.13%。此外，通過(guò)對(duì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，qoxA強(qiáng)化表達(dá)菌株的 ATP濃度 (24 h) 達(dá)到27.67 nmol/L，相比于對(duì)照菌株DW2/pHY300 (20.65 nmol/L) 提高了 34.00%(圖3)。綜上，細(xì)胞色素aa3氧化酶在地衣芽胞桿菌呼吸鏈代謝中發(fā)揮著重要作用，強(qiáng)化表達(dá)qoxA有利于ATP供給和桿菌肽合成。

2.3 強(qiáng)化表達(dá)dck基因提高桿菌肽合成水平

ADP供給水平對(duì)于胞內(nèi)ATP積累及代謝產(chǎn)物合成意義重大。為提高ADP合成水平進(jìn)而提高胞內(nèi)ATP濃度，我們通過(guò)構(gòu)建腺苷激酶DcK、腺苷酸激酶AdK游離表達(dá)載體，分別構(gòu)建了dck和adk過(guò)表達(dá)菌株 DW2/pHY-dck和 DW2/pHY-adk(圖1)。發(fā)酵結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)dck和adk均可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ATP供給水平，同時(shí)桿菌肽效價(jià)相比于對(duì)照菌株也有一定提升，其中強(qiáng)化表達(dá)dck的效果較好，其桿菌肽效價(jià)相比于對(duì)照菌株提高了16.78%，單位菌體桿菌肽合成水平提高了12.48%(圖 4)。

圖2 cydB缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、桿菌肽效價(jià)及胞內(nèi)ATP含量的影響Fig. 2 Effects of deleting cydB on cell growth,bacitracin titer and intracellular ATP contents. (A) The growth curves in LB medium. (B) Bacitracin titers and biomass. (C) The intracellular ATP contents at 24 h.*P<0.05; **P<0.01.

圖3 缺失/強(qiáng)化表達(dá)qoxA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、桿菌肽效價(jià)及胞內(nèi)ATP濃度的影響Fig. 3 Effects of deleting or overexpressing qoxA on cell growth, bacitracin titer and intracellular ATP content.(A) The growth curves in LB medium. (B) Bacitracin titers and biomass. (C) ATP contents at 24 h. *P<0.05;**P<0.01.

2.4 組合代謝工程育種構(gòu)建桿菌肽高產(chǎn)菌株

為進(jìn)一步提高桿菌肽合成水平，在明確單基因工程菌株發(fā)酵效果的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)組合代謝工程育種，進(jìn)一步構(gòu)建桿菌肽高產(chǎn)地衣芽胞桿菌工程菌株。首先，通過(guò)構(gòu)建qoxA基因整合表達(dá)載體，在 DW2ΔcydB中成功整合表達(dá)了qoxA，得到工程菌株 DW2-CQ (DW2ΔcydB::qoxA)。發(fā)酵結(jié)果表明，DW2-CQ桿菌肽效價(jià) (48 h) 達(dá)到904.35 U/mL，相比于對(duì)照菌株DW2和DW2ΔcydB分別提高了 15.30%和 3.96%，胞內(nèi) ATP含量(24 h) 分別提高了 33.80%和 8.81%。隨后，在DW2-CQ基礎(chǔ)上進(jìn)一步整合表達(dá)了dck，得到工程 菌 株 DW2-CQD (DW2ΔcydB::qoxA::dck)。DW2-CQD桿菌肽效價(jià)達(dá)到954.25 U/mL，相比于DW2提高了21.66%，DW2-CQD單位菌體桿菌肽效價(jià)達(dá)到2.11 U/CFU，相比于對(duì)照 (1.90 U/CFU)提高了 11.05%。DW2-CQD最高生物量為451.53×108CFU/mL，相比于DW2提高了9.19%，DW2-CQD最高ATP濃度為39.54 nmol/L，相比于DW2提高了49.32% (表3)。

隨后，我們進(jìn)一步檢測(cè)了菌株 DW2和DW2-CQD的桿菌肽合成曲線。由圖 5可知，DW2-CQD的桿菌肽效價(jià)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均高于對(duì)照菌株，最高值相比對(duì)照提高了21.66%。

圖4 強(qiáng)化ATP合成途徑對(duì)生物量、桿菌肽效價(jià)、胞內(nèi)ATP濃度的影響Fig. 4 Effects of enhancing ATP supply on biomass, bacitracin titer and intracellular ATP content. (A) Bacitracin titers and biomass. (B) ATP contents. *P<0.05; **P<0.01.

表3 工程菌株的桿菌肽效價(jià)、單位菌體桿菌肽效價(jià)、生物量和ATP濃度Table 3 Bacitracin titers, bacitracin titers of per cell, biomass and ATP contents of recombinant strains

圖5 DW2和DW2-CQD的桿菌肽合成曲線Fig. 5 The bacitracin synthesis curves of DW2 and DW2-CQD.

緊接著，我們檢測(cè)了菌株DW2和DW2-CQD在桿菌肽合成對(duì)數(shù)期 (30 h) 的胞內(nèi)外前體氨基酸濃度。如圖6所示，強(qiáng)化ATP供給有利于桿菌肽合成，因此桿菌肽前體氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、賴氨酸等胞內(nèi)濃度均有所下降，此外，其胞外前體氨基酸 (異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、賴氨酸) 濃度低于對(duì)照菌株。由此說(shuō)明，更多的前體氨基酸被用于桿菌肽的生物合成，導(dǎo)致DW2-CQD中前體氨基酸濃度相比于對(duì)照有所降低。

3 結(jié)論與展望

本研究以工業(yè)生產(chǎn)菌株地衣芽胞桿菌 DW2為出發(fā)菌株，針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物桿菌肽合成過(guò)程中ATP供給不足的難題，通過(guò)優(yōu)化呼吸鏈分支途徑、強(qiáng)化 ATP合成途徑等策略，獲得了工程菌株DW2-CQD，與對(duì)照菌株DW2相比，該菌株胞內(nèi)ATP含量和桿菌肽合成水平均顯著提高。

芽胞桿菌是一種重要的工業(yè)微生物生產(chǎn)菌株，其可以合成具有應(yīng)用價(jià)值的化工產(chǎn)品，如聚γ-谷氨酸、透明質(zhì)酸、乙偶姻、丁二醇等，也可以作為蛋白表達(dá)宿主，用于異源蛋白 (酶蛋白和活性多肽等) 高效生產(chǎn)。然而，芽胞桿菌高的維持代謝能是限制其代謝產(chǎn)物高效生產(chǎn)的重要限制因素。人們之前的研究已證實(shí)，芽胞桿菌呼吸鏈有4條分支途徑，分別為細(xì)胞色素bd氧化酶、細(xì)胞色素caa3氧化酶、細(xì)胞色素aa3氧化酶及通過(guò)序列比對(duì)獲得的YthAB。其中，細(xì)胞色素bd氧化酶途徑被認(rèn)為是能耗比較高的途徑，之前的研究中，人們通過(guò)阻斷細(xì)胞色素bd氧化酶分支途徑，減低芽胞桿菌維持代謝能，進(jìn)而提高了核黃素、N-乙酰氨基葡萄糖、聚γ-谷氨酸等產(chǎn)物合成水平。然而，另外3條途徑在細(xì)胞維持能代謝調(diào)節(jié)方面的功能并不清楚。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞色素aa3氧化酶的功能進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素aa3氧化酶表達(dá)對(duì)于菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成十分重要，強(qiáng)化表達(dá)細(xì)胞色素aa3氧化酶有利于桿菌肽合成和胞內(nèi) ATP積累。之前研究已證實(shí)細(xì)胞色素bd氧化酶和aa3氧化酶是芽胞桿菌呼吸鏈的主要分支途徑，而本研究的結(jié)果表明，與細(xì)胞色素bd氧化酶不同，細(xì)胞色素aa3氧化酶則是能耗比較低的分支途徑。因此，細(xì)胞色素aa3氧化酶可以作為代謝工程改造的靶位點(diǎn)用于目的產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的代謝工程育種。此外，盡管本課題之前的研究發(fā)現(xiàn)阻斷ythAB表達(dá)也會(huì)使得聚 γ-谷氨酸產(chǎn)量下降[18]，但YthAB氧化酶與細(xì)胞代謝維持能及目的產(chǎn)物合成的關(guān)系尚待研究。

圖6 DW2和DW2-CQD的胞內(nèi)外前體氨基酸濃度Fig. 6 The intracellular and extracellular concentrations of precursor amino acids of DW2 and DW2-CQD. (A)Intracellular. (B) Extracellular. *P<0.05; **P<0.01.

本研究通過(guò)敲除細(xì)胞色素bd泛醇氧化酶亞基cydB、強(qiáng)化表達(dá)細(xì)胞色素aa3氧化酶亞基qoxA，優(yōu)化了地衣芽胞桿菌呼吸鏈途徑，通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)腺苷激酶基因dck提高了ADP合成水平。通過(guò)上述策略，胞內(nèi)ATP含量達(dá)到39.54 nmol/L，相比于對(duì)照提高了49.32%，工程菌株DW2-CQD桿菌肽產(chǎn)量達(dá)到 954.25 U/mL，相比于對(duì)照提高了21.66%。本研究證實(shí)能量代謝工程是提高桿菌肽合成水平的有效策略，同時(shí)提供了一株具有工業(yè)化應(yīng)用前景的桿菌肽生產(chǎn)菌株。