陳小麗 李紅霞 楊 磊 徐 立

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○六醫(yī)院，浙江 寧波 315040）

線粒體是細胞能量合成中心，是缺血性損害最主要的亞細胞靶區(qū)之一，其功能障礙所致能量耗竭而引發(fā)細胞凋亡和壞死是缺血性腦損傷直接和間接原因［1-2］。白芍總苷為毛茛科白芍屬植物白芍的活性成分，既往張玥［3］、史晴晴［4］等研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠通過改善血液流變學指標、抑制氧化應激和炎癥反應而對缺血性腦損傷起到一定的保護作用，此外史晴晴等［5］還發(fā)現(xiàn)白芍總苷通過抑制細胞凋亡而對腦缺血中樞海馬組織具有保護作用。本實驗將探討白芍總苷預處理對缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體功能的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡雄性SD大鼠，體質量（250±20）g，購自寧波大學實驗動物中心［SYXK（浙）2014-0005］，動物批次號：20181009013。實驗前清潔環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周，光照/黑暗周期1∶1，恒室溫（25±1）℃，相對濕度60%～70%；術前24 h禁食，飲水不限。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號：201804005），尼莫地平片（上海信誼天平藥業(yè)股份有限公司，批號18062405）。2）試劑：ATP測定試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；MPTP開放度、△ψm檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。3）儀器：UV759型紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；Chlorolab-2型氧電極（英國Hansatech公司）；UV759型紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；RM2125型石蠟切片機（德國Leica公司）；MTP-601F型熒光酶標儀［天美（中國）科學儀器有限公司］。

1.3 分組與造模

取120只大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組，模型組，白芍總苷低、中、高劑量組和尼莫地平組，各20只。參照裴科陽等［6］報道，采用線栓法制備缺血性腦損傷大鼠模型：實施麻醉后沿頸部正中切口，剝離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈（充分暴露三者分叉處），結扎頸外動脈，于分叉處近心端頸總動脈切口、插入線栓進頸內動脈，遇阻力止，深度距分叉處約18 mm，固定線栓后逐層縫合，消毒；假手術組除不插入線栓外，其余同模型組。

1.4 干預方法

白芍總苷低、中、高劑量組按50、100、200 mg/（kg·d）給藥，尼莫地平組按1 mg/（kg·d）給藥。藥液配制：1）精確稱取白芍總苷膠囊內充藥物400 mg，加入0.9%氯化鈉溶液10 mL制備白芍總苷溶液，質量濃度為40 mg/mL，并依次稀釋制備20 mg/mL、10 mg/mL質量濃度的白芍總苷溶液。2）尼莫地平片研碎后，精確稱取1 mg尼莫地平粉末并加入0.9%氯化鈉溶液5 mL制備0.2 mg/mL的尼莫地平溶液。假手術組和模型組同步給予等體積（5 mL/kg）的0.9%氯化鈉溶液。各組均于造模術前7 d開始灌胃給藥，每日1次，共28 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 線粒體呼吸功能測定 1）線粒體提取：各組分別隨機取10只大鼠，深度麻醉后斷頭取腦，迅速剝取缺血側海馬組織，參照李富強等［2］報道的方法制備海馬區(qū)線粒體，Lowry法檢測蛋白濃度。2）改良Clark氧電極法［7］測定線粒體呼吸功能：連續(xù)描記Ⅲ態(tài)（R3）快速耗氧及腺苷二磷酸完全磷酸化后的Ⅳ態(tài)（R4）耗氧曲線，R3、R4耗氧速率比值為呼吸控制率（RCR），根據(jù)耗氧曲線計算磷氧比（P/O）和氧化磷酸化效率（OPR）。

1.5.2 線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度測定 取制備的線粒體，通過超聲波破碎后，采用比色法測定ATP含量。采用原子化學發(fā)光法，以CaCO3為標準，測定游離Ca2+濃度。

1.5.3 TEM觀察超微結構 各組取剩余10只大鼠，麻醉后取大腦并進行4%多聚甲醛溶液組織固定，剝離海馬，切割成約1 mm3小塊后置4℃預冷的3%戊二醛溶液中固定2 h，PBS溶液浸洗30 min，置于1%四氧化鋨溶液于4℃下再固定2 h，然后依次經(jīng)梯度酒精脫水、還氧丙烷置換和環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學顯微鏡下定位后，60 nm厚度超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，由10 000倍TEM觀察海馬線粒體超微結構并拍照。

1.5.4 線粒體腫脹程度、膜流動性和膜總磷脂含量測定 1）線粒體腫脹程度［8］：取制備的線粒體懸液并加入適量蔗糖溶液，4℃低溫離心（離心力7 000g，10 min）后去上清，重復1次。依次加入1 mL蔗糖溶液、1 μL CaCl2溶液（濃度200 mmol/L），通過紫外-可見分光光度計測定，A520越小，腫脹程度越高。2）線粒體膜流動性：參照孟偉峰等［9］報道，采用熒光偏振度法測定線粒體膜流動性，通過熒光酶標儀測定熒光偏振度P（激發(fā)波長362 nm，發(fā)射波長432 nm），微黏度（η）=2P（0.46-P），η越小，膜流動性越大。3）膜總磷脂含量：采用Trinder酶試劑盒測定線粒體膜總磷脂含量。

1.5.5 MPTP開放度、△ψm水平測定 1）MPTP開放度測定：遵照試劑盒說明，通過熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長540 nm，發(fā)射波長580 nm），熒光強度越高表示MPTP開放度越高。2）膜電位測定：遵照試劑盒說明，采用JC-1法、通過熒光酶標儀檢測△ψm（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長590 nm）。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行最小顯著差異LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬線粒體呼吸功能指標比較

見表1。較假手術組，模型組呼吸功能指標R3、RCR、P/O、OPR降低且R4顯著升高（P<0.01）。經(jīng)白芍總苷中、高劑量預處理或尼莫地平預處理能夠顯著抑制R3、RCR、P/O、OPR值降低和R4值升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。較尼莫地平組，白芍總苷高劑量預處理組R3值顯著降低（P<0.05），其他指標值兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體呼吸功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體呼吸功能指標比較（±s）

與假手術組比較，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與尼莫地平組比較，#P<0.05。下同

P/O組 別n OPR（nmol/min）161.08±22.53 64.35±10.07**71.46±11.32 98.43±13.15△136.70±23.81△△131.58±25.34△△假手術組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組10 10 10 10 10 10 R3［nmol/（min·mg）］70.41±6.57 42.05±4.99**45.73±5.68 53.51±5.37△△64.15±5.60△△#56.28±5.36△△R4［nmol/（min·mg）］24.20±3.68 31.37±4.54**29.61±4.43 26.37±3.49△△24.28±3.45△△25.11±3.42△△RCR（%）2.79±0.35 1.35±0.23**1.58±0.29 2.10±0.40△△2.57±0.42△△2.49±0.38△△2.51±0.30 1.36±0.22**1.53±0.25 1.88±0.24△△2.34±0.31△△2.28±0.29△△

2.2 各組大鼠海馬線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度指標比較

見表2。較假手術組，模型組大鼠ATP含量顯著降低且游離Ca2+濃度顯著升高（P<0.01）；經(jīng)白芍總苷中、高劑量預處理或尼莫地平預處理能夠明顯抑制ATP含量的降低和游離Ca2+濃度的升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；較尼莫地平組，白芍總苷高劑量組ATP含量顯著升高且游離Ca2+濃度顯著降低（P<0.05）。

表2 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度（±s）

表2 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度（±s）

組別假手術組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組n 10 10 10 10 10 10 ATP（μmol/g）0.99±0.14 0.40±0.07**0.45±0.07 0.67±0.12△△0.84±0.15△△#0.69±0.13△△游離Ca2+（nmol/g）13.01±1.79 29.75±4.57**28.41±4.62 25.58±4.43△20.09±3.30△△#23.94±3.81△△

2.3 各組大鼠缺血側海馬線粒體超微結構改變

見圖1。通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，假手術組線粒體超微結構未發(fā)現(xiàn)明顯異常，模型組呈現(xiàn)線粒體數(shù)量減少，基質透明化，膜磷脂層破壞，水腫、崩解，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大等明顯的病理性形態(tài)結構改變；經(jīng)白芍總苷和尼莫地平預處理能夠不同程度地抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體超微結構病變，以白芍總苷高劑量組最為顯著。

圖1 各組大鼠海馬線粒體超微結構檢查結果（10 000倍）

2.4 各組大鼠缺血側海馬區(qū)線粒體膜腫脹程度、膜流動性、膜總磷脂含量比較

見表3。較假手術組，模型組線粒體膜磷脂層被破壞，A520降低，表現(xiàn)為線粒體膜腫脹，η升高，表現(xiàn)為線粒體膜流動性降低，線粒體膜總磷脂含量降低（P<0.05或P<0.01）。白芍總苷中、高劑量組和尼莫地平組能夠明顯抑制A520值降低，并抑制η值升高，提示白芍總苷和尼莫地平預處理能夠抑制線粒體腫脹、改善線粒體膜流動性，并且白芍總苷中、高劑量預處理能夠明顯抑制膜總磷脂含量降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。較尼莫地平組，白芍總苷高劑量組抑制線粒體腫脹作用顯著升高（P<0.05），兩組間膜流動性和膜總磷脂含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.5 各組大鼠缺血側海馬區(qū)線粒體MPTP開放度、△ψm比較

見表3。較假手術組，模型組MPTP開放度顯著升高且△ψm顯著降低（P<0.01）。經(jīng)白芍總苷中、高劑量和尼莫地平預處理能夠顯著抑制MPTP開放度升高并抑制△ψm降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。與尼莫地平組比較，白芍總苷高劑量組MPTP開放度顯著降低、△ψm顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體腫脹程度、膜流動性、膜總磷脂含量比較（±s）

表3 各組大鼠缺血側大腦海馬區(qū)線粒體腫脹程度、膜流動性、膜總磷脂含量比較（±s）

組別n假手術組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組10 10 10 10 10 10腫脹程度（100×A520值）92.75±9.81 43.48±8.12**膜流動性［η值（Pa/s）］2.81±0.67 4.90±0.54**膜總磷脂含量（mol/mg）453.17±50.86 345.14±46.73**MPTP開放度［熒光強度（RFU）］23584.31±2491.28 40200.52±3517.35**△ψm［熒光強度（RFU）］40597.64±3651.32 25203.38±2758.40**50.25±9.68 68.31±9.76△△82.59±10.28△△#71.64±9.31△△4.48±0.59 4.06±0.63△3.38±0.50△△3.62±0.49△△367.58±44.39 395.70±46.25△416.49±51.37△393.16±41.82△37187.29±3538.60 33467.59±3407.52△△28761.42±3102.76△△##33991.38±3489.72△27425.13±2910.57 29011.47±2949.80△32384.63±3080.25△△#28588.59±2749.32△

3 討 論

線粒體最重要的生理功能之一是通過呼吸鏈反應產(chǎn)生ATP而供給能量，線粒體受損所致能量代謝障礙是缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。本實驗通過改良Clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能，顯示缺血性腦損傷大鼠海馬區(qū)線粒體呼吸功能降低，與李富強等［10］研究結論一致。線粒體呼吸功能降低將直接導致ATP合成受阻并間接影響能量依賴性的ATP酶活性，其中Na+-K+-ATP酶活性降低將導致Na+內流而引發(fā)Na+/Ca2+交換，使Ca2+進入線粒體，正常情況下Ca2+泵能夠在Ca2+-ATP酶作用下被泵出而維持線粒體Ca2+平衡，但ATP合成受阻所致Ca2+-ATP酶活性降低而使線粒體Ca2+泵出受限而引發(fā)鈣超載［11］，并且鈣超載將抑制線粒體氧化磷酸化功能而抑制ATP合成，從而形成“ATP合成障礙-鈣超載-ATP合成障礙”的惡性循環(huán)，最終加重缺血性腦損傷。本實驗研究表明，與模型組、陽性藥物（尼莫地平）預處理組比較，白芍總苷預處理能夠顯著抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體呼吸功能、ATP含量降低，抑制游離Ca2+濃度升高，提示白芍總苷預處理具有保護缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體功能的作用。

線粒體是易受缺血性腦損傷累及的細胞器之一，而線粒體結構完整是維持其功能的基礎。為進一步探討白芍總苷上述作用的機制，本實驗通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)線粒體呈現(xiàn)數(shù)量減少，基質透明化，膜磷脂層破壞，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大等明顯的超微結構病變，該結果與 Jankauskas SS［12］、余婷［13］等的研究結論一致。此外，缺血性腦損傷將導致線粒體膜腫脹程度升高、膜流動性降低、膜磷脂含量降低。線粒體為膜性細胞器，其生理功能依賴膜結構的完整性，而上述3項指標能夠反映線粒體膜完整性及其功能。本研究結果顯示，白芍總苷預處理能夠有效抑制海馬區(qū)線粒體超微結構病變和膜病變。

△ψm對維持線粒體功能起著關鍵作用，其與ATP合成密切相關。Alizadeh R等［14］研究發(fā)現(xiàn)△ψm降低將直接導致ATP合成減少并影響正常生命活動。MPTP是一種非特異性通道，當膜完整性遭到破壞時MPTP開放度升高，致使正常生理狀態(tài)下不能通過的大分子量離子自由通過，破壞離子平衡，此外李強等［15］研究發(fā)現(xiàn)MPTP開放度升高將導致△ψm下降、釋放促凋亡蛋白而觸發(fā)線粒體凋亡通路。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白芍總苷預處理能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠海馬區(qū)線粒體△ψm的降低和MPTP開放度的升高。

綜上所述，白芍總苷預處理具有保護缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體功能的作用，其機制可能與抑制線粒體超微結構病變及保護線粒體膜完整性有關。