陳麗瑩 王潔宜 朱瀟瑩 倪哲婷 江詩夢 王新昌

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

口干燥癥是指口腔干燥以及口腔功能的喪失，具體可由衰老、藥物使用不當、頭頸部惡性腫瘤的放射治療以及干燥綜合征等相關因素引起。老年群體是口干燥癥的高發(fā)群體，是虛證的常見癥狀，陽虛質(zhì)在老年偏頗體質(zhì)中所占比例較高［1］。中醫(yī)認為，在老年患者群體中，陽氣無法推動津液在人體表里上下的輸布，可導致“消渴”“煩渴”等癥狀的出現(xiàn)，五苓散對治療口干燥癥頗有療效。同時，現(xiàn)代醫(yī)學表明，水孔蛋白-5（AQP-5）和口干燥癥有著緊密的聯(lián)系，它是一種主要分布在唾液腺中的跨膜通道蛋白，具有水滲透性特征。正常情況下，它存在于細胞內(nèi)囊泡內(nèi)，在受到體內(nèi)外某些刺激后，出現(xiàn)由囊泡向細胞頂膜“轉位”的現(xiàn)象，從而促進了唾液腺的正常分泌。目前尚未有關于應用五苓散改善口干燥癥機制的研究，故本實驗從中醫(yī)化氣布津的治則出發(fā)，假設五苓散能通過調(diào)控AQP-5分布表達治療腎陽虛型口干燥癥小鼠，以此并展開研究討論，為從現(xiàn)代醫(yī)學角度解釋五苓散治療老年患者腎陽虛型口干癥燥提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡的ICR小鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購買于上海斯萊克實驗動物公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心室，許可證號：SYXK（浙）2013-0184，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.2 藥物與試劑 五苓散，組方：茯苓9 g，澤瀉15 g，豬苓9 g，桂枝6 g，白術（炒）9 g。藥材購于浙江中醫(yī)藥大學名醫(yī)館，分2次煎煮并合并藥液，隨后將藥液稀釋成1 g/mL，4℃保存。氫化可的松注射液（5 mL∶25 mg），天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號H12020886。AQP-5小鼠單克隆IgG1抗體（D-7）：sc514022，購于美國Santa Cruz公司。

1.3 分組與造模 將27只ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、五苓散組，每組9只。模型組、五苓散組每天按25 mg/kg肌肉注射氫化可的松，每日1次，連續(xù)10 d，自由飲水，控制飼料量為每日100～125 g/kg體質(zhì)量，連續(xù)10 d?？瞻捉M每天按0.2 mL/10 g肌肉注射生理鹽水，自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。造模后小鼠較空白組出現(xiàn)體質(zhì)量下降（P<0.05）、飲水減少（P<0.05）、精神倦怠、蜷曲拱背、活動減少、反應遲緩、肢尾發(fā)冷、皮毛無光澤、大便稀溏等腎陽虛表現(xiàn)，說明造模后期小鼠“陰損及陽”的證候改變和老年臟器衰微的氣化功能衰退，提示造模成功。

1.4 給藥方法 中藥組按照小鼠（20 g）體表面積與成人體表面積（70 kg）比計算中藥量，換算系數(shù)為0.0026，造模第11天后中藥組按照每日0.2 mL/10 g灌胃藥液，模型組和空白組按照每日0.2 mL/10 g灌胃蒸餾水。各組小鼠自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。

1.5 一般狀況觀察 1）觀察造模后小鼠精神狀態(tài)、皮毛疏松程度等現(xiàn)象。2）每日測體質(zhì)量1次，并記錄。3）每日測各組水瓶的質(zhì)量，飲水量=（后一天的飲水量-前一天的飲水量）/小鼠數(shù)量。4）測定每只小鼠唾液流量，測定前禁食1 h，不禁水。在小鼠的后頰部用鑷子放入5 mg的干燥無菌脫脂棉球，5 min后取出，電子分析天平上稱重。唾液流量（mg）=棉球濕質(zhì)量-棉球干質(zhì)量。

1.6 標本采集與檢測 1）頜下腺指數(shù)、病理變化。于末次給藥后次日處死小鼠，分離雙側頜下腺稱質(zhì)量，頜下腺指數(shù)（%）=頜下腺濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。頜下腺以40%的多聚甲醛固定24 h后沖洗，經(jīng)酒精逐級脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切成5 μm厚的薄片，HE常規(guī)染色。100倍光鏡下觀察頜下腺病理改變。2）免疫組化法檢測頜下腺AQP-5分布表達。采用免疫組化法，頜下腺蠟塊組織切片，烘烤脫蠟及過水；切片上依次滴加抗原修復液、正常山羊血清封閉液、第一抗體（稀釋濃度為1∶200）、生物素化第二抗體（IgG）、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB顯色；蘇木精復染后透明、中性樹脂封片。AQP-5陽性顆粒DAB顯色為棕褐色及棕黃色。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。比較采用獨立樣本t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般狀況及頜下腺指標比較 見表1。與空白組比，模型組飲水量和唾液流量減少，頜下腺指數(shù)明顯下降，導管上皮個數(shù)明顯減少，表示頜下腺出現(xiàn)明顯萎縮，具有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05）；五苓散組較模型組飲水量和唾液流率增加，頜下腺指數(shù)上升，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），導管上皮個數(shù)有所增加（P>0.05），表示頜下腺萎縮有所緩解。

表1 各組小鼠飲水量、唾液流量、頜下腺指數(shù)、導管上皮細胞個數(shù)比較（±s）

與空白組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別空白組模型組五苓散組n 9 9 9飲水量（mL）5.95±0.55 5.69±0.36*5.73±0.93△唾液流量（mg）23.00±1.90 4.83±1.72*15.33±1.50△頜下腺指數(shù)（%）2.87±1.76 0.38±0.05*0.47±0.06△導管上皮個數(shù)（個/mm2）93.35±17.18 55.37±13.47*66.52±18.03

2.2 各組小鼠頜下腺組織病理學觀察 見圖1?？瞻捉M腺泡細胞、導管和毛細血管形態(tài)正常。模型組出現(xiàn)腺泡細胞萎縮、導管和毛細血管擴張，纖維組織增生等。與模型組相比，五苓散組腺泡細胞萎縮、導管和毛細血管擴張，纖維組織增生等表現(xiàn)減少。

圖1 各組頜下腺病理切片（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠頜下腺免疫組化AQP-5蛋白分布表達 見圖2?？瞻捉MAQP-5的表達分要分布在腺泡細胞的頂膜和基底膜中，在導管上皮中表達較少，染色顯示棕黃或棕褐色顆粒；模型組染色明顯減弱甚至消失；五苓散組可見中等量染色區(qū)域，較模型組染色明顯。

圖2 各組頜下腺AQP-5蛋白表達（DAB染色，100倍）

3 討 論

水孔蛋白（AQPs）在調(diào)節(jié)唾液分泌的水滲透性方面起著重要作用，可以根據(jù)滲透壓/靜水壓力梯度快速進行水的跨膜運動［2］。目前已在哺乳動物中鑒定出13個家族成員（AQP0-AQP12）。鑒于水分運動與唾液分泌息息相關，因此我們選擇在唾液腺中研究AQPs的表達、定位和功能。從功能上講，AQP-5似乎是迄今為止唯一一個在唾液分泌過程中發(fā)揮重要作用的AQP，主要分布在唾液腺的頂膜和基底膜中，與口干燥癥的發(fā)病有著密切聯(lián)系。AQP-5-KO小鼠是唾液腺分泌生理作用的有效模型［3］。在AQP-5-KO小鼠中，毛果蕓香堿刺激的唾液減少超過60%［4］。生理上通過下頜下腺的副交感神經(jīng)和腮腺中的交感激動劑控制，而且自噬和溶酶體介導的降解以及鈣調(diào)蛋白都參與調(diào)控。在病理條件下，LPS在腮腺中的誘導導致NF-κB/MAPK通路被激活，導致轉錄因子NF-κB和AP-1（c-Fos/c-Jun）被激活，形成與NF-κB原件結合的復合物從而下調(diào)AQP-5 mRNA的轉錄［5］。干燥綜合征（一種唾液腺功能減退，以口眼干燥為特征的自身免疫性疾病）中毒蕈堿受體自身抗體導致毛果蕓香堿誘導AQP-5向頜下腺細胞頂膜的運輸減少，表明AQP-5在毒蕈堿受體激動劑誘導的胞吐作用中對唾液腺頂膜運輸?shù)闹匾裕?］。益氣養(yǎng)陰祛瘀方可通過調(diào)節(jié)AQP-5和毒蕈堿膽堿受體3（M3R）通道的作用，從而改善唾液腺的水分分布［7］。各種激動劑對唾液分泌的刺激作用會隨著年齡的增長而降低。在M3R中起作用的乙酰膽堿對細胞頂膜中AQP-5水平的刺激作用在衰老過程中顯著降低。在老化期間，M3R和Gq蛋白的量沒有減少，而是降低一氧化氮合酶的活性。有研究表明，口干燥癥和干燥綜合征患者AQP-5 mRNA表達沒有明顯差異，主要定位于基底膜和腺泡細胞的頂膜中，但未定于導管細胞膜?？诟稍锇Y患者腺泡細胞頂膜AQP-5染色的強度高于對照組，干燥綜合征組低于口干組。AQP-3在口干患者頂膜中幾乎不表達。AQP-5和AQP-3在小唾液腺頂膜中的分布可能是區(qū)分干燥綜合征和口干患者的關鍵因素，但易受到AQP單克隆抗體差異的影響［8］。奎寧環(huán)衍生物SNI-2011（乙酰膽堿類似物，可作用于M3R）誘導頂膜中AQP-5水平的持續(xù)增加，可能對治療與年齡相關的口干燥癥具有治療益處［9］。也有研究表明5-Aza-CdR，一種脫甲基化劑治療老年小鼠的AQP-5蛋白的表達水平遠遠高于未經(jīng)治療和幼鼠的蛋白表達水平，因此認為脫甲基化劑可能是恢復老年人唾液分泌的有效藥物，有利于老年口干燥癥的治療［10］?？傊?，以AQP-5為靶點治療干預與年齡相關的口干燥癥被認為是有前景的策略。

在動物模型選擇上，氫化可的松誘導模型是目前較為理想的腎陽虛模型。激素的應用可使機體在起初呈現(xiàn)煩躁多動等陰虛表現(xiàn)，但是激素的突然停用會導致下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸抑制狀態(tài)暴露，導致機體對外界環(huán)境變化的應激、適應能力顯著下降，水、電解質(zhì)代謝失調(diào)，從而表現(xiàn)一系列的腎陽虛證候，恰符合中醫(yī)所描述的“陰損及陽”的病理過程［11-12］。不僅如此，從HPA軸指標上看，氫化可的松模型也更符合腎陽虛證的要求，且對腎臟無損傷［13］。同時在選擇氣虛模型上，筆者也參考了李軍蘭等［14］通過限制ICR小鼠日攝食量的方法建造氣虛證模型，以模擬老年患者臟器衰微，氣化不利的表現(xiàn)。最后，筆者采用氫化可的松誘導聯(lián)合限制日攝食量法建造出在氣虛基礎上的陽腎虛證模型。造模結束時筆者發(fā)現(xiàn)這些小鼠不但符合腎陽虛的一系列表現(xiàn)，而且頜下腺出現(xiàn)明顯萎縮，且伴有飲水量、唾液流量減少的一系列口干癥狀，十分符合該實驗的造模目的，提示造模成功。

五苓散出自《傷寒論》，是基于化氣布津理論，治療氣化不利，水液內(nèi)停，甚至有飲的主要方劑之一。五苓散主要用于治療水液代謝障礙性疾病，在臨床實際中水液代謝失常出現(xiàn)的少水、積水情況也屬于五苓散證。其中就包括由于腎陽虛衰，津液輸布失常所導致的口干燥癥［15］。《素問·陰陽應象大論》中強調(diào)“陽化氣，陰成形”，陽氣不足、陰氣過盛是導致津液輸布失司，甚至產(chǎn)生水飲的基礎病機。而五苓散雖多見利水滲濕藥，卻是以一味桂枝為主，以桂枝通陽化氣，助津液調(diào)節(jié)，恢復津液吸收、輸布與排泄等正常功能，不僅體現(xiàn)了仲景水病重氣化的治療方法［16］，也與《溫病條辨》中所說的“善治水者，不治水而治氣也”相一致［16］。

本研究結果發(fā)現(xiàn)：通過制作在氣虛基礎上的腎陽虛模型，小鼠唾液腺體萎縮，腺體功能衰退，AQP-5的分布表達發(fā)生變化，AQP-5在頂膜的表達更弱，而在基底膜中表達為陽性。相比較于模型組，通過五苓散干預氣虛基礎上的腎陽虛模型小鼠，小鼠的飲水量、唾液流量增加，頜下腺指數(shù)升高，導管上皮細胞個數(shù)增加，AQP-5在頂膜處染色更強。臨床上老年患者臟器衰微，氣化不利，陽虛型體質(zhì)多見，陽氣無以鼓動，或因干燥綜合征使用激素，后期陰損及陽，所以引發(fā)的口干往往是由于津液不布，而非津液虧虛。因此，筆者從化氣布津的中醫(yī)理論出發(fā)，認為五苓散能夠通過陽氣的溫煦、氣化及蒸騰作用，進而調(diào)整AQP-5在頜下腺的分布表達，在一定程度上緩解口干燥癥的癥狀［17］。然而僅使用組織切片無法區(qū)別AQP-5在腺泡和導管細胞中的運輸，若能采用激光共聚焦顯微鏡進一步研究AQP-5的運輸功能，更有探索價值。本次實驗研究結果，或為中醫(yī)化氣布津理論提供現(xiàn)代化的思考，也為臨床中應用五苓散治療老年腎陽虛型口干燥癥提供一定的現(xiàn)代醫(yī)學依據(jù)。