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        電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后TGF-β1、CTGF、Vimentin表達(dá)的影響?

        2020-07-30 11:26:20李欣怡
        中國中醫(yī)急癥 2020年3期
        關(guān)鍵詞:模型

        魯 曼 徐 菁 李欣怡 陳 莉 陳 潔

        張佳怡1 許 玥1 白玉琢1 張 莉1△ 劉 通2△

        (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.廣東省第二中醫(yī)院,廣東 廣州 510095)

        腰痛是臨床治療中最常見的癥狀之一,多見于腰背部區(qū)域疼痛不適,可沿臀部放射至大腿部,嚴(yán)重者出現(xiàn)麻木、沉重、酸軟、乏力等伴隨癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)[1],慢性腰痛反復(fù)發(fā)生的原因可能有兩點(diǎn):腹部和腰背部核心肌肉群力量減小以及脊柱穩(wěn)定性功能降低。多裂肌是人體重要的核心肌群之一,它位于脊柱兩旁內(nèi)側(cè),能夠協(xié)助脊柱完成側(cè)彎、旋轉(zhuǎn)、前后屈伸等動作,由于其獨(dú)特結(jié)構(gòu),在維持脊柱穩(wěn)定性方面有關(guān)鍵作用[2]。針刺治療腰痛在臨床上已經(jīng)得到普遍認(rèn)可,是臨床治療腰痛常用的方法之一[3-6]。本課題組前期研究表明[7],電針委中穴能夠加速肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的周期性進(jìn)程,進(jìn)而促進(jìn)多裂肌的損傷修復(fù),肌纖維再生和結(jié)締組織生長因子的協(xié)調(diào)作用對肌肉修復(fù)具有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察電針委中穴對多裂肌修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、波形纖維蛋白(Vimentin)的表達(dá)變化,進(jìn)一步研究電針委中穴對骨骼肌修復(fù)過程中肌纖維再生以及纖維化因子的影響,并且找到針灸治療的最佳療程。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠,8周齡,54只,體質(zhì)量(280±20)g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號:SCXK(京)2016-0006],所有大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng),進(jìn)食和飲水不受限,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,明暗周期各12 h,環(huán)境溫度24℃,濕度40%~50%。

        1.2 試劑與儀器 主要試劑:布比卡因(美國Sigma公司);10%水合氯醛(北京歐北生物);16%多聚甲醛溶液(北京雷根生物);Masson三色染色試劑盒(北京So?larbio公司);TGF-β1抗體,CTGF抗體和Vimentin抗體(美國proteintech公司);山羊抗兔IgG(北京鼎國昌盛);抗體稀釋液(北京鼎國昌盛);DAB顯色液(北京鼎國昌盛)。主要儀器:韓式電針儀(北京思盛達(dá)醫(yī)療器械中心);半自動化石蠟切片機(jī)(北京弘泰嘉業(yè));電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石恒豐);顯微鏡及成像軟件系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會社)。

        1.3 分組與造模 采用完全隨機(jī)數(shù)字表法將54只大鼠分為空白組、模型組和電針委中組,每組18只,各組再隨機(jī)分為3個時間點(diǎn)(治療1、3、7 d),每個時間點(diǎn)6只。除空白組不做任何處理外,其余各組以10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉,操作過程必須在無菌的環(huán)境下,然后剔除大鼠腰背部毛發(fā),找到大鼠L4、L5水平棘突對應(yīng)兩側(cè)的4個點(diǎn)進(jìn)針,針頭緊貼棘突旁進(jìn)入肌肉,直到觸及關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面后再回抽無血時,以每個點(diǎn)100 μL注入0.5%布比卡因溶液,且時間不得短于3 s,這樣更加有利于藥物的吸收。

        1.4 干預(yù)方法 空白組不進(jìn)行任何處理。電針委中組在造模后24 h進(jìn)行治療,將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)室操作桌上,暴露出雙側(cè)后肢的腘窩部,找到委中穴(膝關(guān)節(jié)背面正中的位置),用一次性針灸針(華佗牌,0.30 mm×13 mm)直刺3 mm,再接上韓式電針儀,采用2~100 Hz的疏密波,電流1 mA,每日治療1次,每次治療20 min。模型組造模后不做治療,只需與電針委中組同步進(jìn)行固定。

        1.5 標(biāo)本采集與檢測 各組大鼠分別在治療1、3、7 d后進(jìn)行取材,用10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射,大鼠完全處于麻醉狀態(tài)下后,將其固定在鼠板上,充分暴露背部,剔除背毛,剪開皮膚,剝離開筋膜、肌肉,銳性切取L4~5水平的多裂肌,左側(cè)迅速放于液氮中固定,隨后-80℃進(jìn)行保存,右側(cè)置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。1)Masson染色觀察多裂肌形態(tài)學(xué)變化。右側(cè)多裂肌在4%多聚甲醛溶液中固定好后,石蠟包埋,組織切片。將切片放在二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理,然后用梯度乙醇和蒸餾水水洗;Weigert鐵蘇木素染色5 min;酸性乙醇分化10 s;藍(lán)化液返藍(lán)3 min;蒸餾水洗1 min;麗春紅品紅染色5 min;弱酸工作液洗1 min;磷鉬酸洗1 min;再用弱酸工作液洗1 min;苯胺藍(lán)染色2 min;弱酸工作液洗1 min;梯度乙醇脫水?dāng)?shù)次;二甲苯透明;中性樹膠進(jìn)行封片。最后借助顯微鏡在鏡下觀察各組多裂肌組織形態(tài)的變化。2)免疫組化法(IHC)檢測TGF-β1、CTGF、Vimentin的表達(dá)。將切片放在65℃環(huán)境下烤片處理15 min,然后二甲苯脫蠟兩次,15 min/次;梯度乙醇脫水(100%,90%,75%,50%);高壓鍋熱抗原修復(fù)處理;PBS沖洗;滴加雙氧水室溫下孵育15 min;滴加正常非免疫血清,37℃下孵育30 min封閉;滴加一抗后4℃孵育過夜(TGF-β1按照1∶200稀釋,CTGF按照1∶200稀釋,Vimentin按照1∶1 000稀釋);滴加山羊抗兔IgG(1∶25稀釋),37℃下孵育40 min;滴加DAB顯色工作液,然后在顯微鏡下觀察,出現(xiàn)棕黃色后可隨時終止反應(yīng);蘇木素(1∶25稀釋)復(fù)染10 min,;脫水透明,中性樹膠進(jìn)行封片。在顯微鏡下觀察采集圖像,然后用Image Professional Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析處理。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,組間差異用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠的腰多裂肌組織形態(tài)學(xué)變化 見圖1??瞻?、3、7 d組可見到大量紅染的肌纖維整齊排列;模型組可見散狀、星點(diǎn)、不規(guī)則分布的紅色肌纖維,而藍(lán)色的膠原纖維則大量分布;針刺委中組與模型組相比,可以見到被紅染的肌纖維,而藍(lán)色的膠原纖維則相對減少。

        圖1 各組大鼠腰多裂肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(Masson染色,200倍)

        2.2 各組大鼠腰多裂肌組織中TGF-β1表達(dá)水平比較 見表1,圖2。治療1、3、7 d時,同時間點(diǎn)模型組與電針委中組TGF-β1的表達(dá)均高于空白組(P<0.01),與模型組相比,同時間點(diǎn)電針委中組的表達(dá)有所減少(P<0.01)。

        表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        與空白組比較,?P<0.05,??P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同

        組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.038±0.016 0.091±0.016**0.067±0.009**△△3 d 0.056±0.008 0.101±0.007**0.076±0.006**△△7 d 0.050±0.007 0.094±0.007**0.075±0.011**△△

        圖2 各組大鼠不同時間點(diǎn)腰多裂肌TGF-β1表達(dá)(免疫組化染色,200倍)

        2.3 各組大鼠腰多裂肌組織中CTGF表達(dá)水平比較見表2,圖3。治療1 d時,與空白組比較,模型組與電針委中組的CTGF表達(dá)有所上升(P<0.01或P<0.05);與模型組比較,電針委中組的表達(dá)量減少(P<0.05)。治療3 d時,模型組表達(dá)量高于空白組(P<0.01),電針委中組表達(dá)量也高于空白組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與模型組比較,電針委中組的表達(dá)量更低(P<0.05)。治療7 d時,模型組與電針委中組表達(dá)量高于空白組(P<0.01),且電針委中組的表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.01)。

        表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.057±0.016 0.105±0.017**0.080±0.012*△3 d 0.054±0.015 0.090±0.019**0.066±0.006△7 d 0.043±0.012 0.132±0.033**0.089±0.017**△△

        圖3 各組大鼠不同時間點(diǎn)腰多裂肌CTGF表達(dá)(免疫組化染色,200倍)

        2.4 各組大鼠腰多裂肌組織中Vimentin表達(dá)水平比較 見表3,圖4。治療1 d時,模型組與電針委中組的Vimentin的表達(dá)量較空白組增加(P<0.01),與模型組比較,電針委中組的表達(dá)量較模型組增加(P<0.01)。治療3 d時,與空白組比較,模型組與電針委中組表達(dá)量明顯上升(P<0.01);電針委中組的表達(dá)量比模型組更高(P<0.01)。治療7 d時,模型組與電針委中組表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.01),與模型組比較,電針委中組的表達(dá)量有所上升(P<0.05)。

        表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達(dá)水平比較(MOD值,±s)

        組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.052±0.016 0.082±0.007**0.119±0.016**△△3 d 0.037±0.012 0.077±0.007**0.118±0.007**△△7 d 0.044±0.012 0.084±0.008**0.104±0.017**△

        圖4 各組大鼠不同時間點(diǎn)腰多裂肌Vimentin表達(dá)(免疫組化染色,200倍)

        3 討 論

        在全世界范圍內(nèi),約有80%的人群患有慢性腰痛。腰痛癥狀輕重不一,嚴(yán)重者會影響工作、學(xué)習(xí)以及生活各個方面,其中大約25%的患者會選擇就醫(yī)[8],以減輕不適感。有研究表明,腰痛患者中大部分存在多裂肌萎縮[9]以及脂肪浸潤[10],而且浸潤程度與年齡增長呈正相關(guān),這與多裂肌的分布位置和本身具有的獨(dú)特結(jié)構(gòu),以及維持腰椎穩(wěn)定性功能有關(guān)。有研究報道,布比卡因作為局麻藥起效迅速,而且與給藥部位有關(guān),3種藥物相比,布比卡因最容易引起肌肉的毒性,而且它導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞數(shù)量最多[11];在運(yùn)動阻滯效應(yīng)方面,它所起的效果明顯高于另外兩種藥物[12]。本實(shí)驗(yàn)大鼠模型制備選擇肌肉注射0.5%布比卡因溶液,是因?yàn)樗男?yīng)具有選擇性,只會影響肌纖維而并不改變基底膜以及細(xì)胞的再生能力,而且0.5%布比卡因起到阻滯作用的同時,不具有任何血流動力學(xué)副作用[13],不影響與骨骼肌修復(fù)再生能力相關(guān)的其他因素。實(shí)驗(yàn)證明損傷后24 h介入電針治療是多裂肌修復(fù)的最佳時機(jī)[14],因此本實(shí)驗(yàn)選擇干預(yù)時機(jī)為造模后24 h,觀察多裂肌修復(fù)過程中,不同治療療程組大鼠多裂肌肌纖維的表達(dá)變化。

        TGF-β1可以通過激活衛(wèi)星細(xì)胞,調(diào)節(jié)結(jié)締組織再生,改變免疫反應(yīng)強(qiáng)度這幾個方面來參與骨骼肌的損傷修復(fù)[15],而骨骼肌萎縮是TGF-β1調(diào)節(jié)的病理狀態(tài)之一[16],會出現(xiàn)肌肉力量減弱和肌肉質(zhì)量下降的表現(xiàn)。有研究證明[17],TGF-β1能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖,進(jìn)而誘發(fā)肌肉纖維化發(fā)展。謝慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)可以抑制TGF-β1/Smad3信號通路,緩解腓腸肌萎縮的進(jìn)程,加速肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化,促進(jìn)骨骼肌纖維再生修復(fù)。仝樂[19]研究表明電針穴位之后,TGF-β1的表達(dá)降低,細(xì)胞外基質(zhì)的沉淀會減少,肌纖維的再生與修復(fù)能力能夠得到促進(jìn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,治療1 d和3 d時,電針委中組TGF-β1的表達(dá)比模型組減少(P<0.01),說明了TGF-β1在損傷修復(fù)過程中被抑制,細(xì)胞外基質(zhì)沉淀減少,進(jìn)而促進(jìn)肌肉修復(fù)。電針委中組治療7 d時,和3 d時的表達(dá)維持在同一水平線上,幾乎沒有差異,這說明電針委中穴治療能夠在多裂肌損傷修復(fù)的早期發(fā)揮抑制肌肉纖維化因子的作用,進(jìn)而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化,減少損傷肌肉修復(fù)過程中的負(fù)效應(yīng)。

        CTGF是結(jié)締組織生長因子,器官組織的纖維化發(fā)展與其有密切的關(guān)系?,F(xiàn)有研究表明[20],作為促組織纖維化蛋白,當(dāng)機(jī)體組織處于損傷情況下時,CTGF會大量分泌,而且與皮膚瘢痕形成、血管粥樣硬化、損傷修復(fù)障礙、器官組織纖維化發(fā)展具有一定的聯(lián)系[21]。孫桂蓮等[22]研究表明,CTGF的表達(dá)增強(qiáng)與進(jìn)行性肌肉營養(yǎng)不良患兒的肌肉萎縮纖維化關(guān)系密切,在纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。吳珍元等[23]研究表明不同強(qiáng)度電針刺激可以抑制靶器官的結(jié)締組織再生,減輕失神經(jīng)骨骼肌萎縮程度,從而防止纖維化。治療1 d和3 d時,同時間點(diǎn)電針委中組與模型組相比CTGF的表達(dá)減少(P<0.05),治療7 d時,電針委中組的表達(dá)低于模型組(P<0.01),同時電針委中7 d組比電針委中3 d組表達(dá)增加,這說明電針在抑制結(jié)締組織生長因子的過程中,3 d組的抑制能力最強(qiáng),隨后減弱。

        Vimentin作為一種細(xì)胞骨架蛋白,是肌肉損傷修復(fù)病理學(xué)研究領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)[24]。有研究表明[25],在肌肉再生的早期過程中,Vimentin能夠促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活,在肌肉損傷修復(fù)方面發(fā)揮著重要的作用。治療1 d和3 d時,與模型組相比,電針委中組Vimentin的表達(dá)增加(P<0.01),治療7 d時,電針委中組與模型組之間也有明顯差異(P<0.05),但7 d時電針委中組表達(dá)低于治療3 d時。這說明在電針委中的干預(yù)過程中,治療3 d時,損傷肌肉恢復(fù)的效果達(dá)到最佳。

        “腰背委中求”,是歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)的總結(jié),從古至今,一直是針灸醫(yī)生臨床選穴治病的理論支持。足太陽膀胱經(jīng)的經(jīng)絡(luò)循行路線經(jīng)過脊柱兩側(cè),并且到達(dá)腰部,其中一分支從臀部穿過到達(dá)腘窩處,即委中穴所在的位置;足太陽膀胱經(jīng)與足少陰腎經(jīng)相表里,二者分布于下肢外側(cè)后緣和內(nèi)側(cè)后緣,且腰為腎之府;足太陽經(jīng)筋起于足小趾,沿跟腱向上止于腘窩部,因此委中穴既是膀胱經(jīng)的合穴、下合穴,也是足太陽經(jīng)筋其中一分支的結(jié)所在;委中穴位于腘橫紋的中點(diǎn)處,解剖位置在股二頭肌肌腱與半腱肌肌腱之間,從脊髓節(jié)段角度而言,腰背部神經(jīng)節(jié)段與委中穴的傳入神經(jīng)分布有相互重疊的部分,會互相影響。以上幾點(diǎn)從中醫(yī)角度說明“經(jīng)脈所過,主治所及”的原則、特效穴和特殊穴的運(yùn)用,以及從西醫(yī)角度解釋委中穴的解剖位置以及委中穴與腰痛神經(jīng)節(jié)段的相關(guān)性,為臨床治療腰痛提供了可靠的依據(jù)。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究表明,電針委中穴可以通過下調(diào)TGF-β1和CTGF的表達(dá),同時增加Vimentin的表達(dá),來促進(jìn)損傷骨骼肌的修復(fù),從肌纖維再生的角度說明,電針委中穴治療骨骼肌損傷病變,最佳治療時長可能是持續(xù)3 d,與肌肉纖維化相關(guān)的因子在此刻能得到最大效力的針刺抑制作用,此時骨骼肌修復(fù)的效果達(dá)到最優(yōu)。

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