李佳奇，于 卓，于肖夏，張 勝，楊東升，盧倩倩，吳國芳，牛亞青青

(內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古呼和浩特 010019)

冰草(AgropyronGaertn.)為禾本科小麥族多年生植物，在我國主要分布于內蒙古的中西部及寧夏、甘肅、新疆等干旱地區(qū)[1]。其須根系發(fā)達且具沙套，分蘗數多、莖稈直立、密叢生長，具有抗旱、抗寒、抗病、耐貧瘠等優(yōu)異特性。冰草生長期長，再生性強，產草量較高，草質柔嫩，適口性好，富含粗蛋白質、礦物質等營養(yǎng)成分，為禾本科牧草中品質較高的草種之一，是人工單播和混播草地建植的優(yōu)良牧草[2-5]。冰草具有防風固沙、保持水土、環(huán)境綠化等多種用途[6]。此外，冰草也是近緣麥類作物抗逆性遠緣雜交遺傳改良研究的重要種質材料之一[7]。

牧草中的碳水化合物是草食家畜生長發(fā)育的重要營養(yǎng)物質，主要包括可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，簡稱WSC)和淀粉。其中WSC能夠有效促進家畜對蛋白質等營養(yǎng)物質的吸收利用，提高適口性、采食量和消化率[8]；淀粉(starch)是重要能量物質，可維持家畜正常生長及生產等一系列生命活動。牧草粗纖維(crude fibre)主要包括纖維素、半纖維素和木質素，雖然牧草中適量的的粗纖維可促進家畜腸胃蠕動和對其他營養(yǎng)成分的消化吸收，但牧草粗纖維含量越高其營養(yǎng)品質越低[9]。目前，國內外對牧草品質育種的重要目標是提高WSC和淀粉的含量，適當降低牧草的粗纖維含量[10]。而傳統(tǒng)雜交育種等方法很難對牧草的可溶性碳水化合物、淀粉和粗纖維等品質性狀進行改良。隨著分子生物學技術快速發(fā)展，牧草品質的分子育種(轉基因育種、分子標記輔助育種)越來越受到重視。

植物數量性狀QTL定位是深入開展優(yōu)異基因圖位克隆、功能解析及標記輔助育種的基礎工作，目前在農作物上已有不少研究報道[11-14]。對牧草QTL定位研究的報道卻很少，且多集中在產量等農藝性狀方面，如苜蓿[15]、黑麥草[16]、鴨茅[17]、高丹草[18]等草種。關于牧草營養(yǎng)品質性狀的QTL定位研究還十分薄弱，僅見于紫花苜蓿[19]、賴草[20]和雜花苜蓿[21]。在四倍體雜交冰草(蒙古冰草Agropyronmongolicum×航道冰草Agropyroncristatumcv.Fairway，2n=4x=28)上只有本課題組楊東升等[22]對粗蛋白、粗脂肪2個品質性狀進行了定位分析。

本試驗以四倍體雜交冰草F2群體的246個無性系分離單株及其親本為材料，在課題組已構建的雜交冰草高密度遺傳連鎖圖譜的基礎上(圖譜含1 729個SSR和SRAP標記、平均間距1.96 cM、14個連鎖群、覆蓋基因組總長度3 270.5 cM)，重點對雜交冰草的WSC、淀粉和粗纖維3個品質含量性狀的QTL進行定位分析，以期為今后深入開展這些營養(yǎng)品質性狀的QTL精細定位、主效基因圖位克隆、功能分析及標記輔助育種研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料為246個四倍體雜交冰草F2無性系分離單株及其親本蒙古冰草與航道冰草，種植于呼和浩特市內蒙古農業(yè)大學試驗農場，具灌水條件，沙壤質土，pH為7.6，種植株距25 cm、行距40 cm。在生長期內，及時防除雜草，并根據植株生長情況適時適量施肥(拔節(jié)期施尿素225 kg·hm-2，開花期施磷酸鉀肥料150 kg·hm-2)灌水，確保植株生長對養(yǎng)分和水分的需求。

1.2 營養(yǎng)品質性狀的測定

2018年和2019年6月下旬，在冰草盛花期分別從各材料的株叢中隨機剪取的50個有效分蘗株，裝入標有序號的羊皮紙袋內帶回實驗室，置于溫干燥箱中105 ℃下殺青20 min后，轉入 60 ℃恒溫箱中烘干48 h。取出晾至室溫，待樣品重量恒定，用手提式高速粉碎機打成粉末狀后放入標有同序號的塑封袋中。

用美國產近紅外谷物品質分析儀(Spectra Star 2500XT)對各材料樣品的WSC、淀粉、粗纖維含量進行測定，重復3次。

1.3 數據的整理與分析

利用Excel 2003對數據進行整理，用SPSS 22.0 進行分析。

1.4 各品質性狀的QTL定位

在本課題組已構建的高密度雜交冰草分子遺傳連鎖圖譜上，利用Map QTL 4.0 軟件對測定的各品質性狀數據進行QTL定位。操作過程為：用區(qū)間作圖法(Interval mapping，IM)在冰草14個連鎖群上對各品質性狀數據進行QTL掃描檢測，設置掃描步長為1 cM，連鎖系數LOD(logarithm of odds)閾值>2.5；依據掃描結果尋找各品質性狀的QTL在不同連鎖群上與其緊密連鎖的分子標記數目和位置，并確定其貢獻率和遺傳效應。檢測到的各性狀QTL位點命名方法為：q+所測性狀的英文名縮寫+連鎖群+年份(1代表2018年，2代表2019年)+QTL數[23]。

2 結果與分析

2.1 冰草品質性狀分析

由表1可知，2018年和2019年父本航道冰草的WSC和淀粉含量均極顯著高于母本蒙古冰草，而母本的粗纖維含量顯著高于父本，表明親本間的3個被測品質性狀均存在顯著差異。2018和2019兩年一地條件下雜交冰草F2群體246個單株的WSC、淀粉和粗纖維含量性狀分離明顯，且多數單株的3個被測指標值介于雙親之間，少部分單株呈超親現象，3個品質性狀的變異系數范圍為5.22%～14.10%，表明F2群體的WSC、淀粉和粗纖維含量的遺傳變異豐富。

表1 雜交冰草3個品質性狀分析

246個單株的3個品質性狀均表現為明顯的單峰曲線，符合正態(tài)型分布規(guī)律，表明這3個性狀均為數量性狀遺傳，可對其進行QTL定位分析[24](圖1)。

A和B分別代表2018年和2019年；F和M分別代表父本航道冰草和母本蒙古冰草。

2.2 冰草3個品質性狀的QTL定位

如圖2所示，在LOD值>2.5條件下，兩年一地測定的冰草WSC、淀粉和粗纖維含量3個品質性狀的QTLs有85個，它們分布在冰草的14個連鎖群上。在兩個不同年度條件下都出現的穩(wěn)定QTLs有11個，分布在LG1、LG3、LG8、LG9、LG10和LG14這6個連鎖群上，遺傳貢獻率在10.1%～41.4%之間，其作用方式以部分顯性為主(表2)。

▲表示在兩年一地條件下均檢測到的穩(wěn)定QTLs。

表2 雜交冰草3個品質性狀的穩(wěn)定QTL及遺傳效應

2.2.1 WSC含量的QTL

檢測到控制冰草WSC含量性狀的QTLs有37個，分布在14個連鎖群上，以LG14連鎖群分布最多(5個)，遺傳貢獻率為14.2%～52.2%。兩年內都檢測到控制WSC性狀的穩(wěn)定QTLs有5個，貢獻率超過20%的主效QTLs有3個，分別是qwsc1-1(2)-1、qwsc10-1(2)-2和qwsc14-1(2)-3。其中qwsc1-1(2)-1與bm10e11-1216--xtxp20-984標記區(qū)間緊密連鎖，qwsc14-1(2)-3與Xtxp31-206--m10e8-351標記區(qū)間緊密連鎖，qwsc10-1(2)-2與標記m2e3-348*共分離。

2.2.2 淀粉含量的QTL

檢測到16個控制冰草淀粉含量性狀的QTLs，分布在LG3、LG4、LG7、LG9、LG10和LG14連鎖群上，遺傳貢獻率在10.8%～25.3%之間。兩年內均檢測到的穩(wěn)定QTLs有2個，即qst3-1(2)-5和qst9-1(2)-1，其中qst3-1(2)-5為遺傳貢獻率超過20%的主效QTL，它與標記Xtxp3-662共分離。

2.2.3 粗纖維含量的QTL

檢測到控制冰草粗纖維含量性狀的QTLs有32個，分布在14個連鎖群上，以LG12、LG4和LG1連鎖群分布最多，遺傳貢獻率為10.1%～41.4%。兩年內均檢測到的穩(wěn)定QTLs有4個，分別是qcf1-1(2)-3、qcf1-1(2)-5、qcf1-1(2)-8和qcf8-1(2)-2，作用方式為部分顯性與超顯性，其中有2個遺傳貢獻率>20%的主效QTLs，即qcf1-1(2)-3和qcf8-1(2)-2，它們分別與bm9e6-1349--xtxp20-682和Xtxp183-627--m4coe9-317標記區(qū)間緊密連鎖。

3 討 論

在植物多個性狀的QTL定位中，普遍存在一因多效現象，即一個QTL位點同時控制多個性狀[25]。如在水稻[26]、小麥[27]、玉米[28]等植物的重要性狀QTLs檢測中均發(fā)現一因多效現象。本試驗發(fā)現，在冰草11個穩(wěn)定的QTLs中，控制WSC含量性狀的qwsc1-1(2)-2和控制粗纖維含量性狀的qcf1-1(2)-3均位于連鎖群LG1上的169.7 cM處，與bm9e6-1349--xtxp20-984標記區(qū)間緊密連鎖，且為遺傳貢獻率>20%的主效QTL。這表明冰草營養(yǎng)品質性狀中也存在一因多效現象，該QTL位點在冰草目標性狀標記輔助選擇育種時有一定的應用價值。

多數研究表明，在兩個及兩個以上的不同環(huán)境條件下均可檢測到控制植物某一數量性狀的QTL即為穩(wěn)定位點[29，30]。Cui等[31]用3個相關的RIL群體在4個環(huán)境條件下檢測到與小麥籽粒大小、籽粒重量相關的23個穩(wěn)定的QTLs；Hamwieh等[32]在3個不同濕度梯度的環(huán)境下，對鷹嘴豆的豆莢數、種子數等性狀進行QTL定位共得到2個穩(wěn)定QTLs。本試驗在對冰草WSC、淀粉和粗纖維含量3個品質性狀兩年一地研究中，共定位了85個QTLs，在兩年均出現的穩(wěn)定QTLs有11個，占總數的12.94%，且遺傳貢獻率超過20%的主效QTLs有6個(控制冰草WSC含量的有3個、控制淀粉含量的有1個、控制粗纖維含量的有2個)，所檢測出的穩(wěn)定QTLs數量較多，這可能其無性繁殖特點有關，具體還有待深入研究。

4 結 論

在課題組已構建的冰草高密度分子遺傳連鎖圖譜上，定位了與冰草WSC、淀粉和粗纖維含量性狀的QTLs共85個，兩年一地環(huán)境條件下同時出現的穩(wěn)定QTLs有11個；其中遺傳貢獻率超過20%的主效QTLs有6個，分別是qwsc1-1(2)-1、qwsc10-1(2)-2、qwsc14-1(2)-3、qst3-1(2)-5、qcf1-1(2)-3和qcf8-1(2)-2。試驗明確了各QTL在冰草14個連鎖群上的分子標記位點及遺傳 效應。