李添夢(mèng),胡小平，杜光源，范三紅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

赤霉病(Fusarium head blight)是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害[1]，該病害由禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)引起，不同地域復(fù)合種的組成有所不同。引起我國(guó)小麥赤霉病的主要病原菌為禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌，其中小麥玉米輪作區(qū)以禾谷鐮刀菌為主，小麥水稻輪作區(qū)以亞洲鐮刀菌為主[2-3]。赤霉病病原菌主要侵染小麥穗部，會(huì)引起籽粒發(fā)育不良，病原菌合成的毒素在籽粒中的累積，還會(huì)對(duì)人畜健康和食品安全造成嚴(yán)重威脅[4-6]。

禾谷鐮刀菌可以合成單端孢霉烯族的真菌毒素，常見(jiàn)的類型有4種：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)和雪腐鐮刀菌烯醇(nivalend,NIV)[7-8]，其中DON是帶病小麥籽粒中毒素的主要存在形式。DON毒素可以干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻礙核糖體的正常循環(huán)，從而抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[9]。大量攝入DON會(huì)引起急性中毒[10-11]，主要表現(xiàn)有頭疼、頭暈、嘔吐及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[12]。因而，赤霉菌毒素導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題引起國(guó)家管理部門及研究者的高度關(guān)注。

鐮刀菌中參與毒素合成的基因有12～16個(gè)[13]，命名為Tri基因，不同菌株參與的基因數(shù)目有所不同。這些基因主要集中在兩個(gè)基因簇中，其中最大的一個(gè)基因簇命名為Tri5，包含了Tri3、Tri4、Tri5、Tri6、Tri7、Tri8、Tri9、Tri10、Tri11、Tri12、Tri13和Tri14共12個(gè)Tri基因；另一個(gè)基因簇中包含了Tri1和Tri16兩個(gè)基因，Tri15和Tri101游離于上述基因簇之外[14]。DON生物合成的直接前體為法尼基焦磷酸(FPP)，在Tri5基因編碼產(chǎn)物的催化下，法尼基首先環(huán)化形成單端孢霉二烯(TDN)[15]；在Tri4編碼的P450家族單加氧酶催化下進(jìn)行3次羥化反應(yīng)和1次環(huán)加氧反應(yīng)，形成異構(gòu)單端孢霉三醇[16-17]；該化合物可自發(fā)脫水環(huán)化形成異構(gòu)木霉菌醇；在Tri101、Tri11和Tri3編碼產(chǎn)物催化下進(jìn)行1次羥基化和2次乙酰化形成麗赤殼菌素(CAL)；CAL在Tri1編碼的P450羥化酶催化下，在7，8兩個(gè)位置引入2個(gè)羥基[18]，最終形成DON前體3,15-diAcDON；Tri8編碼分泌型酯酶，可催化3,15-diAcDON 3位或15位乙酰基的水解，從而形成3-AcDON或15-AcDON[19]，不同的鐮刀菌編碼的Tri8基因有所不同，有些可催化3位乙?；乃猓渌麆t催化15位乙?；乃鈁20]；3-AcDON或15-AcDON可自發(fā)，或在病菌或植物酯酶的催化下水解剩余的乙?；罱K形成DON。

研究表明，亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)主要產(chǎn)生3-AcDON和NIV類型毒素，而禾谷鐮刀菌(F.graminearum)主要產(chǎn)生15-AcDON[21]。其中NIV類型菌株產(chǎn)生的NIV毒素含量極低。本研究利用基因敲除技術(shù)獲得Tri8基因缺失的禾谷鐮刀菌株系，并對(duì)其產(chǎn)生毒素的類型進(jìn)行了定性分析，以期為DON合成前體3,15-diAcDON的制備及Tri8蛋白體外活性分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H-1和農(nóng)桿菌菌株EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存，載體pOSCAR和pA-HYG-OSCAR由本實(shí)驗(yàn)室保存，PrimerSTAR DNA polymerase、PstI、BamHI、HindIII和XhoI購(gòu)自Takara公司(大連)，DNA快速提取試劑盒(DSBIN1151)購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，無(wú)縫克隆試劑盒CloneExpressTM為南京諾唯贊生物科技公司。混合毒素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司(北京)。

1.2 方 法

1.2.1 基因敲除載體構(gòu)建

利用CTAB法提取野生型禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1基因組DNA，以其為模板，利用引物Tri8-wf-uF/uR和Tri8-wf-dF/dR(表1)分別擴(kuò)增Tri8基因上下游片段Tri8-up和Tri8-down，其長(zhǎng)度分別為1 078 bp和1 213 bp。PCR反應(yīng)體系為：100 ng· μL-1的DNA模板0.5 μL、10 μmol·L-1的正反向引物各0.5 μL、2×Buffer 12.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTP 0.5 μL、1 U· μL-1的KOD酶0.5 μL、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。利用PstI、BamHI酶切載體pA-HYG-OSCAR，并通過(guò)膠回收獲得1 425 bp的抗性基因片段HYG。

表1 引物序列

通過(guò)重疊PCR對(duì)上述三個(gè)片段進(jìn)行連接(順序?yàn)門ri8-up、HYG、Tri8-down)。PCR反應(yīng)體系為：100 ng· μL-1的Tri8-up、Tri8-down和HYG基因片段各0.5 μL、2×Buffer 12.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 0.5 μL、1 U· μL-1KOD酶0.5 μL、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。前期PCR反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸3.2 min，5個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。以上反應(yīng)體系不加入引物，反應(yīng)結(jié)束后加入引物Tri8-wf-uF、Tri8-wf-dR各 0.5 μL，后期PCR反應(yīng)體系為；95 ℃變性5 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸3.2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。利用HindIII、XhoI對(duì)pOSCAR載體進(jìn)行雙酶切，切膠回收并利用無(wú)縫克隆將其與通過(guò)重疊PCR獲得的Tri8-up-HYG-Tri8-down片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化篩選最終獲得Tri8基因敲除載體pOSCAR-△Tri8。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將基因敲除載體pOSCAR-△Tir8轉(zhuǎn)至PH-1野生菌株，具體過(guò)程參考Zahi等[22]的報(bào)道。在陽(yáng)性基因敲除菌株篩選過(guò)程中，首先利用引物HYG-F/R擴(kuò)增HYG基因，初步判斷Tri8基因敲除是否成功，之后利用引物Tri8-F/R擴(kuò)增Tri8基因，進(jìn)一步確定Tri8基因是否成功敲除。

1.2.3 基因敲除菌株與原始菌株的產(chǎn)毒類性 分析

將對(duì)照菌株和Tri8基因敲除菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱活化3～5 d，挑取菌塊接種至CMC培養(yǎng)基中，25 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液用濾布過(guò)濾獲得孢子液。將孢子液加入大米培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng) 30 d，取出培養(yǎng)基液氮速凍后研磨至粉末狀，加入400 mL甲醇，200 r·min-125 ℃過(guò)夜抽提。將培養(yǎng)物用三層濾紙過(guò)濾，濾液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸餾，濃縮至50 mL，-20 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除載體pOSCAR-△ Tri8的構(gòu)建

Tri8基因敲除載體構(gòu)建流程如圖2所示。依據(jù)禾谷鐮刀菌基因組序列設(shè)計(jì)Tri8基因上下游擴(kuò)增引物，并以基因組為模版擴(kuò)增獲得上下游片段Tri8-up(1 078 bp)和Tri8-down(1 213 bp)。PstI、BamHI雙酶切pA-HYG-OSCAR質(zhì)粒，通過(guò)膠回收獲得潮霉素抗性基因編碼片段HYG(1 425 bp)。然后利用重疊PCR技術(shù)將三者連接獲得敲除片段Tri8-up:HYG:Tri8-down。HindIII、XhoI雙酶切pOSCAR載體，切膠回收獲得包含T-DNA左右邊界的載體，然后通過(guò)無(wú)縫克隆技術(shù)將其與敲除片斷連接，最終獲得敲除載體pOSCAR-△Tri8。利用PCR方法對(duì)敲除載體進(jìn)行初步篩選，然后將陽(yáng)性重組子送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的敲除載體pOSCAR-△Tri8的序列與設(shè)計(jì)完全一致。

圖1 基因敲除載體pOSCAR-△ Tri8構(gòu)建流程

2.2 基因敲除株系的篩選與鑒定結(jié)果

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將敲除片段導(dǎo)入禾谷鐮刀菌PH-1中，利用同源重組機(jī)制將原有的Tri8置換為潮霉素抗性基因HYG。首先利用電激法將敲除載體pOSCAR-△Tri8導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，將其與鐮刀菌PH-1的孢子進(jìn)行孵育，然后置于含有潮霉素的PDA平板進(jìn)行篩選。提取陽(yáng)性菌斑DNA，分別利用潮霉素抗性基因特異引物HYG-F/R和Tri8基因特異引物Tri8-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，能擴(kuò)增出HYG對(duì)應(yīng)片段而不能擴(kuò)增出Tri8對(duì)應(yīng)片段的株系則為Tri8基因敲除株系PH-1-△Tri8。選取20個(gè)菌株提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示大部分樣品均擴(kuò)增出896 bp的潮霉素抗性基因特異條帶(圖2A)。但候選敲除菌株樣品6和18菌株菌絲較少，未成功提取其基因組DNA，故未成功擴(kuò)增出896 bp的潮霉素抗性基因特異條帶。結(jié)果表明，除了野生菌株P(guān)H-1外，其他候選敲除菌株樣品中均未擴(kuò)增出Tri8基因?qū)?yīng)的1 388 bp特異條帶(圖2B)，說(shuō)明候選敲除菌株中(除樣品6和18)的Tri8基因已被HYG基因替換。

A:HYG基因擴(kuò)增結(jié)果; B: Tri8基因擴(kuò)增結(jié)果; M:1 kb DNA Ladder; 1:野生型菌株P(guān)H-1; 2～21:候選敲除菌株。

2.3 基因敲除株系的產(chǎn)毒類型檢測(cè)結(jié)果

按照材料與方法1.2.3所示流程對(duì)野生型菌株P(guān)H-1和Tri8基因敲除株系進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)，利用高分辨離子淌度液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)粗提液的組分進(jìn)行定性分析。發(fā)現(xiàn)野生型菌株中出峰時(shí)間為 4.97～5.00 min 的DON為最主要成分，同時(shí)存在少量的3-AcDON或15-AcDON，其出峰時(shí)間為5.98～6.00 min(圖3A)；Tri8敲除株系中3-AcDON或15-AcDON含量最高，含有少量DON，在出峰時(shí)間6.48～6.51 min處出現(xiàn)第三個(gè)主峰，依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量判斷此峰為3,15-diAcDON。與野生型菌株相比，Tri8基因敲除株系不同菌株的DON相關(guān)組分含量變化一致，均出現(xiàn)一定程度DON前體3,15-diAcDON的累積。

A:野生型菌株P(guān)H-1; B: Tri8基因敲除菌株。

3 討 論

由于赤霉菌毒素會(huì)對(duì)人畜健康造成嚴(yán)重威脅，因而赤霉菌毒素生物合成、分泌及調(diào)控機(jī)制一直是赤霉病研究的熱點(diǎn)[24]。Tri8編碼一種分泌型酯酶，可將禾谷鐮刀菌合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外的毒素前體3,15-diAcDON上的乙?；庖瞥?，形成只包含一個(gè)乙?；难苌?5-AcDON或3-AcDON[19]，后者可自發(fā)或在其他病原菌或宿主酯酶作用下移除另一個(gè)乙酰基，最終形成DON。劉楊楊等[21]研究表明，PH-1菌株產(chǎn)毒類型主要為15-AcDON，即其Tri8編碼酯酶可催化雙乙酰前體3位乙?；乃?。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型菌株P(guān)H-1的毒素組分主要為DON，少量為 3/15-AcDON，而非理論上的以15-AcDON為主。表明在我們所給的實(shí)驗(yàn)條件下[25]，大部分15-AcDON可進(jìn)一步自發(fā)或在其他酯酶催化下水解剩余的15位的乙?；纬蒁ON。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，Tri8基因敲除株系產(chǎn)生的毒素以3/15-AcDON為主，并存在少量DON和3,15-diAcDON，而非理論上以3,15-diAcDON前體為主?？紤]到野生型對(duì)照中大部分15-AcDON會(huì)因?yàn)樽园l(fā)或在其他病原菌或宿主酯酶作用下移除另一個(gè)乙?；D(zhuǎn)化為DON，因而突變體中大部分3,15-diAcDON被轉(zhuǎn)化為3/15-AcDON也在情理之中。無(wú)論如何上述結(jié)果都能說(shuō)明，Tri8基因敲除會(huì)導(dǎo)致雙乙酰毒素前體的累積。

Tri8酯酶催化3,15-diAcDON乙酰基水解，是DON毒素合成和活化的重要步驟，要闡明該酶的催化機(jī)制首選需要制備出該酶足夠的底物3,15-diAcDON。本研究創(chuàng)制Tri8基因缺失突變體的初衷就是為了讓3,15-diAcDON在培養(yǎng)基中積累，然后抽提、分離制備獲得3,15-diAcDON。從已有的結(jié)果來(lái)看，Tri8基因的敲除的確可以導(dǎo)致3,15-diAcDON的累積，但大部分又自發(fā)轉(zhuǎn)化為3/15-AcDON。在后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，減少3,15-diAcDON的自發(fā)轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)3,15-diAcDON的大量累積，為后續(xù)Tri8基因結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用重疊PCR和無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建了禾谷鐮刀菌Tri8基因敲除載體pOSCAR-△Tri8，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化篩選鑒定出Tri8