翟飛紅 張 勇 趙文婧 陳立英

（1 太原師范學(xué)院生物系，山西晉中030600；2 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030000）

羊肚菌（MorchellaSPP.）是一種珍稀名貴的子囊菌，因菌蓋部分凹凸成蜂窩狀，形態(tài)酷似翻開的羊肚（胃）而得名，其味道鮮美且風(fēng)味獨(dú)特[1]，可謂是近幾年食用菌界的“網(wǎng)紅”。羊肚菌為野生菌，已實(shí)現(xiàn)部分人工化栽培。自2012 年至2018 年以來，羊肚菌的栽培面積逐年上升，目前，我國的羊肚菌栽培面積為全世界的90%。香菇（Lentinula edodes）和真姬菇（Hypsizygus marmoreus）是兩種常見的食用菌，因其良好的口感和豐富的營養(yǎng)頗受人們喜愛[2-3]。

食用菌中富含多酚類化合物，多酚類物質(zhì)根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為很多種，包括酚酸類、黃酮、單寧、羥基苯甲酸類、木質(zhì)素類等，具有較強(qiáng)的抗氧化性，如DPPH·清除能力、鐵離子還原能力及氧自由基吸收能力等，還有降血糖、降血脂、抗衰老、消炎等功效[4-6]。目前對(duì)于羊肚菌的研究主要集中在菌種篩選、栽培條件、出菇管理以及培養(yǎng)料的篩選等。此外，還有部分對(duì)其營養(yǎng)成分的研究，如蛋白質(zhì)、氨基酸等。對(duì)于羊肚菌活性成分的研究較少，且大多集中在其多糖的組成和功效上[7-10]，對(duì)于其多酚和抗氧化性的研究較少。研究測定并比較羊肚菌、香菇、真姬菇的多酚含量及乙醇提取物的體外抗氧化活性（DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力和還原力），以期為開發(fā)利用這3 種食用菌資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梯棱羊肚菌和香菇由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供；真姬菇購自山西省太原市美特好超市。

石油醚（30～60 ℃）、乙醇、福林酚、碳酸鈉、三氯乙酸、NaH2PO4、Na2HPO4、FeCl3、FeCl2、K3Fe（CN）6均為國產(chǎn)分析純；沒食子酸，色譜純（北京Solarbio 公司）；DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼），F(xiàn)errozine（菲洛嗪），Sigma公司。

紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 食用菌子實(shí)體中抗氧化物質(zhì)的提取

3 種食用菌子實(shí)體中抗氧化物質(zhì)的提取按照Chethan 等人[11]的方法略作改動(dòng)。分別準(zhǔn)確稱取2 g食用菌子實(shí)體粉末，采用索氏抽提法加入石油醚（30～60 ℃）進(jìn)行脫脂。將脫脂后的子實(shí)體粉末轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入20 mL 70%乙醇，25 ℃、150 r/min 的搖床上提取4 h，離心收集上清液，采用相同方法對(duì)濾渣重復(fù)提取2 次，合并3 次濾液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積，保存待測。

1.3 多酚含量的測定

多酚含量的測定采用福林酚比色法（Folin-Cioncalteu colorimetric method）[12]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y= 0.0093X+0.0393（R2= 0.9999，X為沒食子酸的濃度，Y為對(duì)應(yīng)濃度下的OD 值）。食用菌子實(shí)體中多酚的含量用每克樣品（干重）中的沒食子酸當(dāng)量來表示，單位為：mg 沒食子酸當(dāng)量/g干重（mg GAE/g）。

圖1 多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 提取物體外抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH·清除能力的測定

DPPH·的乙醇溶液在517 nm 處有強(qiáng)烈吸收，當(dāng)溶液中存在自由基清除劑時(shí)，紫色變淺，吸光度值變低，根據(jù)這一原理，參照文獻(xiàn)[13]略做修改測定DPPH·清除能力。在2 mL 不同濃度的樣液中加入2 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），搖勻，靜置30 min，對(duì)照用乙醇代替樣品，空白管為樣品加70%的乙醇（即DPPH的溶劑），517 nm處測OD值。

DPPH清除能力=[1－（A1－A2）/A0]×100

式中，A0為對(duì)照吸光度值，A1為樣品吸光度值，A2為空白吸光度值。

1.4.2 還原力的測定

Fe3+溶液呈黃色，溶液中存在鐵氰化物時(shí)，F(xiàn)e3+與鐵氰化物形成復(fù)合物，當(dāng)往溶液存在還原劑時(shí)，會(huì)使該復(fù)合物轉(zhuǎn)化為亞鐵形式的化合物（普魯士藍(lán)（Fe4[Fe（CN）6]3）），從而使溶液由黃色變?yōu)椴煌潭鹊木G色或藍(lán)色。根據(jù)這一原理，參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行還原力的測定。在1 mL 不同濃度的樣液中分別依次加入 2.5 mL 磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（1%），50 ℃保溫20 min，然后迅速冷卻，加入2.5 mL 三氯乙酸溶液（10%），離心，取上清液。1.25 mL上清液中依次加入1.25 mL蒸餾水和0.25 mL 氯化鐵溶液（0.1%），混合均勻，靜置10 min，700 nm 處測 OD 值，OD 值越大，表示還原力越強(qiáng)。

1.4.3 Fe2+螯合能力的測定

Fe2+可與Ferrozine 形成一種紅色的復(fù)合物，當(dāng)溶液中有螯合劑存在時(shí)，螯合劑會(huì)破壞該紅色復(fù)合物結(jié)構(gòu)，使得紅色變淺，根據(jù)這一原理，參照文獻(xiàn)[15]的方法略做部分修改測定Fe2+螯合能力。在1.6 mL不同濃度的樣液中分別依次加入1.6 mL 蒸餾水、0.4 mL 氯化亞鐵（0.5 mmol/L）、0.4 mL Ferrozine（0.5 mmol/L），然后劇烈搖動(dòng)1 min，室溫放置20 min后，562 nm 處測OD 值?？瞻坠埽ˋ0）用蒸餾水代替樣液。

Fe2+螯合能力=[（A0－A1）/A0]×100%

式中，A1為樣品吸光度值，A0為空白吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)均數(shù)間的兩兩比較采用Duncan 多重比較法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種食用菌子實(shí)體中的多酚含量

由圖2 可以看出，羊肚菌、香菇、真姬菇子實(shí)體中的多酚含量具有顯著差異（P＜0.05）。其中，真姬菇子實(shí)體中的多酚含量為1.63 mg GAE/g，香菇子實(shí)體中的多酚含量為1.89 mg GAE/g，羊肚菌子實(shí)體中的多酚含量最高，為4.35 mg GAE/g。羊肚菌子實(shí)體中的多酚含量分別為真姬菇、香菇的2.7倍、2.3倍。

圖2 三種食用菌子實(shí)體中的多酚含量

2.2 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物的DPPH·清除能力

由圖3 可以看出，羊肚菌、香菇、真姬菇乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力均是隨著提取物濃度的提高而逐漸加強(qiáng)，當(dāng)羊肚菌、香菇、真姬菇的乙醇提

取物濃度達(dá)到 8.2 μg/mL 時(shí)，對(duì) DPPH 的清除能力達(dá)到最大，分別為92.38%、61.50%、59.81%。由此也可以看出，羊肚菌子實(shí)體乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)于香菇、真姬菇。為了更好地反應(yīng)三者乙醇提取物對(duì)DPPH·清除能力的強(qiáng)弱，試驗(yàn)計(jì)算三者DPPH·清除能力的EC50值（表1）。由表1 可知，羊肚菌乙醇提取物對(duì)DPPH·清除能力的EC50值顯著低于香菇、真姬菇（P＜ 0.05），香菇、真姬菇提取物對(duì)DPPH·清除能力的EC50值之間沒有顯著差異（P＜0.05）。這說明羊肚菌子實(shí)體乙醇提取物對(duì)DPPH·清除能力顯著強(qiáng)于香菇、真姬菇（P＜ 0.05）。

表1 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物抗氧化指標(biāo)的EC50值

圖3 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物DPPH·清除能力

2.3 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物的Fe2+螯合能力

由圖4可以看出，3種食用菌子實(shí)體乙醇提取物對(duì)Fe2+的螯合能力隨提取物濃度的提高而增強(qiáng)，總體而言，真姬菇子實(shí)體提取物的Fe2+螯合能力強(qiáng)于羊肚菌、香菇。當(dāng)真姬菇子實(shí)體乙醇提取物濃度為8.20 μg/mL 時(shí)，其對(duì)Fe2+的螯合能力達(dá)到79.15%，而當(dāng)羊肚菌、香菇乙醇提取物濃度為82.00 μg/mL時(shí)，其對(duì)Fe2+的螯合能力僅為52.40%、35.79%。由此可以看出，真姬菇子實(shí)體提取物對(duì)Fe2+的螯合能力顯著強(qiáng)于羊肚菌、香菇。為了更好地反應(yīng)三者對(duì)Fe2+的螯合能力的強(qiáng)弱，計(jì)算了3種提取物對(duì)Fe2+螯合能力的EC50值（表1）。由表1可知，按照3種提取物對(duì)Fe2+螯合能力的強(qiáng)弱排序?yàn)檎婕Ч剑狙蚨蔷鞠愎剑艺婕Ч綄?duì)Fe2+的螯合能力顯著強(qiáng)于羊肚菌和香菇（P＜0.05）。

圖4 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物Fe2+螯合能力

2.4 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物的還原力

由圖5 可以看出，隨著3 種食用菌子實(shí)體乙醇提取物濃度的提高，所得的OD 值也逐漸上升，這說明還原力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)3種食用菌提取物的濃度達(dá)到82.00 μg/mL 時(shí)，羊肚菌、香菇、真姬菇的OD 值分別為1.52、0.57、0.32，這說明該濃度時(shí)羊肚菌的還原力顯著強(qiáng)于香菇，香菇的還原力顯著強(qiáng)于真姬菇（P＜0.05）。為了更直接地反應(yīng)三者還原力強(qiáng)弱，計(jì)算了三者還原力的EC50值（表1）。由表1可知，還原力的強(qiáng)弱排序?yàn)檠蚨蔷鞠愎剑菊婕Ч剑已蚨蔷倪€原力顯著強(qiáng)于香菇、真姬菇（P＜0.05）。

圖5 三種食用菌子實(shí)體乙醇提取物還原力

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)測定結(jié)果表明，羊肚菌子實(shí)體中的多酚含量最高，為真姬菇、香菇子實(shí)體的2.7倍、2.3倍；羊肚菌子實(shí)體乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力和還原力顯著強(qiáng)于香菇、真姬菇；真姬菇子實(shí)體乙醇提取物的Fe2+螯合能力顯著強(qiáng)于羊肚菌、香菇。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，就同一種食用菌而言，測定的3 個(gè)抗氧化指標(biāo)的EC50值有較大差別，對(duì)同一個(gè)抗氧化活性指標(biāo)，3 種食用菌提取物的抗氧化強(qiáng)弱也有較大差別：三者的DPPH·清除能力較強(qiáng)，真姬菇提取物的Fe2+螯合能力也較強(qiáng)。

很多研究結(jié)果表明，多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，多酚的含量與自由基的清除能力高度相關(guān)，而且多酚的功效與多酚的組成成分有很大的關(guān)系[4]185，[17]6，[18]651。例如：Gangopadhyay 等人對(duì)多酚提取物中多酚的不同組分對(duì)抗氧化能力所做貢獻(xiàn)的大小進(jìn)行了排序：黃烷醇類＞黃酮醇類＞羥基肉桂酸類[19]。盧可可等人對(duì)3 種尖頂羊肚菌中的多酚組成及其抗氧化性測定結(jié)果表明，不同羊肚菌的多酚組成及其含量差異較大，抗氧化能力也有較大差異[20]。鄭少杰等人在體外模擬消化的黑脈羊肚菌（M.angusticepes）多酚，測定了其細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性，結(jié)果表明，體外模擬消化處理的黑脈羊肚菌具有一定的抗氧化及抗人肝癌細(xì)胞（HepG2 細(xì)胞）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2 細(xì)胞）的增殖活性[21]。此外，陳龍等人的研究結(jié)果表明，多酚組成及其抗氧化活性會(huì)受到提取劑的影響[22]。綜合這些研究結(jié)果，筆者認(rèn)為3種食用菌提取物中的多酚組成或者其他抗氧化成分組成差異較大，導(dǎo)致3 種食用菌提取物的不同抗氧化指標(biāo)的差異。今后應(yīng)采用不同的溶劑提取3 種食用菌子實(shí)體的多酚等抗氧化物質(zhì)，并對(duì)其組成進(jìn)行分離鑒定，以期找到抗氧化物質(zhì)組成與抗氧化活性之間的相關(guān)性。

在食用菌中，除了多酚之外，還有很多其他具有抗氧化活性的成分，如多糖等。范三紅等利用DEAE-52 纖維素層析柱和Sephadex G-100 層析柱分離純化赫赭羊肚菌（M.umbrina）的多糖組分，并對(duì)不同多糖的抗氧化活性（還原力以及DPPH·、·OH、ABTS·和O2-·的清除能力）進(jìn)行測定，結(jié)果顯示不同多糖組分的抗氧化性有較大差異[23]。楊小斌等人測定了羊肚菌（M.esculenta）水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）壽命、產(chǎn)卵量以及蟲體內(nèi)的活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）積累量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）酶的活力的影響。結(jié)果表明，羊肚菌水提物能夠顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命，有效延緩其衰老，提高產(chǎn)卵量，改善機(jī)體的抗氧化能力[24]。Cai等人測定了羊肚菌（M.esculenta）的多糖組分及抗氧化活性，結(jié)果表明羊肚菌多糖可以通過降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，提高SOD、CAT 和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathioneporosidase，GSH-Px）的活性來起到抗氧化的作用[7]。Meng 等人對(duì)一株野生六妹羊肚菌（M.sextelata）菌絲體的多糖組分及其功效進(jìn)行了分析，結(jié)果所得到的多糖組分可以通過刺激巨噬細(xì)胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為一種新型潛在的免疫增強(qiáng)劑[25]。這些研究結(jié)果表明，羊肚菌等食用菌中的多酚和多糖除了具有抗氧化活性還有很多其他的功效。此外，在這些食用菌中還存在很多其他功能活性的成分，在今后研究中應(yīng)該系統(tǒng)進(jìn)行測定分析，以期為開發(fā)利用這些食用菌提供充足的理論依據(jù)。