劉 堯 冮 潔* 鄧海平 曲鵬坤 袁家誠 宋文俊

（1大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600；2 銅仁科學(xué)院梵凈山生物資源研究所，貴州銅仁554300）

黑木耳（Auricularia auricular）屬于擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科，大多呈黑褐色、透明、膠質(zhì)狀，是一種高營養(yǎng)價值的真菌，是世界上最重要的四大栽培食用菌之一［1］。黑木耳富含碳水化合物、氨基酸、微量元素等成分，同時含有較多的功能性營養(yǎng)成分，更能作為藥材來廣泛的使用［2］。黑木耳具有抗腫瘤［3］、抗凝血［4］、提高人體免疫力［5］、降低血液膽固醇［6］、抗氧化和延緩衰老［7］等多種功能。然而由于傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的特殊性，黑木耳在栽培過程中很容易被雜菌污染，主要原因?yàn)榧庸ぴO(shè)備簡陋、環(huán)境衛(wèi)生較差等［8］。

關(guān)于黑木耳污染分析，目前已有較多研究報(bào)道。劉振東等［9］研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用簡易滅菌鍋黑木耳料袋滅菌的最佳時間為9 h，栽培袋養(yǎng)菌期間最佳溫度為20 ℃，在林芝市選擇4 月上旬進(jìn)行下地栽培管理為最適時間，在田間管理階段，栽培袋最佳劃口形狀為“/”形，最佳劃口數(shù)量為140 個，在此條件下，黑木耳菌袋染菌率最低；吳翔等人［10］通過rDNA ITS 區(qū)序列的綜合分析發(fā)現(xiàn)，毛木耳在栽培過程中會被空氣中的真菌感染，主要真菌種類有曲霉屬、木霉屬、藍(lán)狀菌屬、鏈格孢屬；崔麗紅［11］研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳污染菌棒上分離鑒定的真菌種類中青霉屬最多，從污染真菌分離率來看，木霉屬分離率最高，為37.56%，其次是青霉屬15.02%，曲霉屬10.33%，鐮孢菌屬8.45%，脈孢屬4.23%，孢子絲菌屬4.70%，其他屬占19.71%。

微生物鑒定方法受到培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制，因此大多數(shù)微生物難以分離［13］。由于某些微生物的特殊生長需求及培養(yǎng)條件的限制，用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物所占比例不到環(huán)境樣品的1%［14］。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）已廣泛應(yīng)用于微生物多樣性分析［15-16］。以Illumina MiSeq［17］為代表的高通量測序技術(shù)，為分析生態(tài)環(huán)境菌群多樣性提供了有效手段，該技術(shù)無需對樣品中微生物進(jìn)行分離純化，可直接對樣品基因組脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）進(jìn)行分析，能夠快速、直接和真實(shí)的反映菌群物種豐度及差異［18-20］。高通量測序技術(shù)可以在短時間內(nèi)對幾十萬、甚至百萬計(jì)的序列進(jìn)行檢測分析，具有同時分析多個樣品，安全性和自動化程度高，數(shù)據(jù)量大，誤差小，分析全面等特點(diǎn)［21-22］。目前高通量測序技術(shù)已成功應(yīng)用于香菇［23］、滑菇［24］、羊肚菌［25］、松茸［12］、雙孢蘑菇［26］等食用菌微生物多樣性的分析。但運(yùn)用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對黑木耳污染菌棒的微生物多樣性的研究未見報(bào)道。筆者采用高通量測序?qū)F州銅仁栽培的黑木耳染菌菌棒的污染真菌群落組成、多樣性和豐度進(jìn)行分析，為黑木耳的栽培和雜菌防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2%Agarose Gels（Biowest Agarose），西 班 牙Biowest公司；FastPfu Polymerase，北京全式金生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.?soil 試劑盒（Omega-soil DNA Kit），美 國 Omega Bio-Tek 公 司 ；Illumina MiSeq Platform（TruSeqTMDNA Sample Prep Kit），美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

移液器（N13462C），德國Eppendorf 公司；高速臺式冷凍離心機(jī)（5424R），德國Eppendorf 公司；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000），美國Thermo Fisher 科學(xué)技術(shù)公司；電泳儀（DYY-6C），北京市六一儀器廠；PCR 儀（ABI GeneAmp?9700 型），美國ABI 公司 ；MiSeq 測序儀（Illumina MiSeq），美國Illumina 公司；酶標(biāo)儀（BioTek ELx800），美國Biotek公司。

1.3 供試樣品

供試樣品分別為FY4（由銅仁方圓合作社提供）、FY9（由銅仁方圓合作社提供）、CY5（由銅仁程耀食用菌發(fā)展有限公司提供）、CY8（由銅仁程耀食用菌發(fā)展有限公司提供）。每個樣品重復(fù)3個，且均為第一潮黑木耳菌棒（黑木耳栽培品種為黑3，栽培配方為：雜木屑90%，麩皮8%，石膏2%）。每一個菌棒人工采集5 g污染部位于無菌無霉凍存管中，立即放入液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱待用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總DNA提取

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA提取，利用NanoDrop2000 對DNA 的純度和濃度進(jìn)行檢測，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。

1.4.2 PCR擴(kuò)增及測序

用提取總DNA作為模板，以ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和 ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC -3’）為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 采用 TaKaRa rTaq DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系。10×Buffer：2 μL；2.5 mM dNTPs：2 μL；Forward Primer（5 μM）：0.8 μL；Reverse Primer（5 μM）：0.8 μL；rTaq Polymerase：0.2 μL；BSA：0.2 μL；Template DNA：10 ng；ddH2O：4 μL。采用ABI GeneAmp?9700 型 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)參數(shù)：a.1×（3 minutes at 95 ℃）b.35×（30 seconds at 95 ℃ ；30 seconds at 55 ℃ ；45 seconds at 72 ℃）c.10 minutes at 72 ℃，10 until halted by user。利用Illumina 公司的MiSeq Platform 平臺進(jìn)行測序。PCR擴(kuò)增及測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。然后Usearch（Vsesion 7.0 http：//drive5.com/uparse/）軟件得到干凈的序列，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OUT 聚類；使用UCHIME 軟件提出嵌合體，將分類注釋的序列對比Unite（Release 7.0 http：//unite.ut.ee/index.php）的真菌數(shù)據(jù)庫。比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)及組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的基因組DNA 作為模板，用ITS1F_ITS2R 的通用引物擴(kuò)增出的片段見圖1，PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度適合，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定膠圖

2.2 測序數(shù)據(jù)分析

通過Illumina MiSeq 高通量測序的方法對ITS1F_ITS2R 區(qū)測序發(fā)現(xiàn)，所有菌棒共得到高質(zhì)量質(zhì)控序列827 819 個序列標(biāo)簽，平均長度為277.15 bp。表明所得到的有效序列可達(dá)到后續(xù)微生物多樣性分析的要求。進(jìn)而對樣品的序列進(jìn)行聚類分析，在97%相似水平下的OUT 生物信息統(tǒng)計(jì)分析，總共聚成69 個OUT，不同樣品的測序結(jié)果如表1 所示。通過統(tǒng)計(jì)OUT 得到了域：1，界：1，門：5，綱：14，目：25，科：35，屬：42，種：54的結(jié)果。

表1 OUT物種分類統(tǒng)計(jì)

2.3 菌棒中真菌群落的多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OUT 信息，采用Alpha 多樣性指標(biāo)的 Ace、Chao、Shannon、Simpson及Coverage 指數(shù)對樣品微生物物種豐富度、多樣性及覆蓋度進(jìn)行評估，結(jié)果見表2。從稀釋曲線可以反映樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。由圖2 可以看出所有樣品的曲線都隨著橫坐標(biāo)而逐漸穩(wěn)定，說明測序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多。此外，從分類水平為OUT 進(jìn)行Coverage 指數(shù)分析，Coverage 指數(shù)均達(dá)到99%以上，說明樣品中序列未被測到的概率較低。

表2 菌棒微生物多樣性指數(shù)

2.3.2 Beta多樣性分析

在 Heatmap 圖中，X 和 Y 軸均為樣本，樣本間的距離用不同顏色梯度表示，顏色越深表示距離較近，顏色越淺表示距離較遠(yuǎn)，白色表示距離居中。如圖3所示，所有樣本的距離情況，基本表現(xiàn)為組內(nèi)差異較小，部分組間差異較大的情況。其中FY4 和FY9兩組差異較小，CY5和CY8兩組差異較小。

圖2 菌棒的稀釋曲線

2.4 黑木耳污染菌棒真菌群落組成分析

2.4.1 污染真菌屬分類水平比較

分析各組樣品在科分類水平上菌群的組成和結(jié)構(gòu)，其中屬水平上相對豐度大于1%的菌群柱狀分布圖見圖4。共鑒定出4個菌屬，分別為蠟孔菌屬（Ceriporia）、曲 霉 屬（Aspergillus）、木 霉 屬（Trichoderma）和Others。FY4 的相對豐度較高的菌屬為蠟孔菌屬，占6.50%；CY5 的相對豐度較高的菌屬為曲霉屬，占57.06%；CY8 中的相對豐度較高的菌屬木霉屬，占30.22%；FY9 中的相對豐度較高的菌屬為蠟孔菌屬，占99.99%。由此可知FY4 和FY9的優(yōu)勢菌屬為蠟孔菌屬，CY5的優(yōu)勢菌屬為曲霉屬。

圖3 屬水平樣本距離Heatmap圖

圖4 樣本屬分類水平菌群分布

2.4.2 聚類熱圖（Heatmap圖）分析

如圖4 所示，從Heatmap 聚類分析的結(jié)果可以看出，在屬水平上，所有樣本中，蠟孔菌屬（Ceriporia）、曲 霉 屬（Aspergillus）、木 霉 屬（Trichoderma）等屬占比較大，即相對豐度高。該結(jié)果印證了Beta多樣性分析中屬水平的結(jié)果（圖5）。

2.5 黑木耳污染菌棒真菌組間差異分析

選擇Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在科分類水平上4 個樣本在原毛平革菌科（Phanerochaetaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）上有顯著性差異（*：0.01＜P≤0.05，**：0.001＜P≤0.01），如圖6 所示。其中各組的相對豐度如表3所示。

在屬分類水平上4 個樣本在蠟孔菌屬（Ceriporia）、曲 霉 屬（Aspergillus）、木 霉 屬（Trichoderma）上有顯著性差異（*：0.01＜P≤0.05，**：0.001＜P≤0.01），如圖7 所示。其中各組所長的相對豐度如表4所示。

圖5 含系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的群落Heatmap圖（屬水平）

表3 菌棒樣本微生物科分類水平上的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表

圖6 菌棒樣本微生物科分類水平上的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)豐度圖

3 小結(jié)與討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全國食用菌總產(chǎn)量為3712萬t，產(chǎn)值達(dá)2721.92 億元；其中黑木耳是第二大品種，產(chǎn)量為751.85萬t，同比增長10.62%[27]。而貴州省地處山區(qū)，具有溫暖潮濕，雨水充沛的特點(diǎn)，適合各類食用菌生長，擁有食用菌資源268種，野生食用菌占全國80%以上[28]。貴州省將食用菌產(chǎn)業(yè)作為助推脫貧攻堅(jiān)的重要途徑，近年來食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，黑木耳是主要栽培品種。但黑木耳栽培模式是“北耳南移”，貴州盛夏生產(chǎn)，秋冬春季出耳，出耳期降雨多光照不足，加之黑木耳菌絲自身生長微弱，抗逆性較差，易被雜菌感染，從而導(dǎo)致農(nóng)民經(jīng)濟(jì)上遭受損失。

表4 菌棒樣本微生物屬分類水平上的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表

圖7 菌棒樣本微生物屬分類水平上的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)豐度圖

為了揭示染菌菌棒的真菌菌群結(jié)構(gòu)，防控雜菌污染，筆者采用高通量測序的方法，對貴州銅仁提供的染菌菌棒的污染真菌組成和多樣性進(jìn)行了鑒定。 在門水平上，主要菌門為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（ascomycota）、未分類菌門（Unclassified_k_Fungi）、接合菌門（zygomycota）和壺菌門（chytridiomycota）；在科水平上主要為未命名菌 科（Norank_o_Auriculariales）、原 毛 平 革 菌 科（Phanerochaetaceae）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）和肉座菌科（Hypocreaceae）；在屬水平上，主要為蠟孔菌屬、曲霉屬、木霉屬。通過OUT 分析發(fā)現(xiàn)染菌組所得微生物菌屬共計(jì)42種。主要污染菌為蠟孔菌屬、曲霉屬、木霉屬。并且有三組菌棒主要染菌微生物不是真菌，觀察三組菌棒的實(shí)際情況可以看出，菌棒污染部分都呈現(xiàn)綠色，因此污染青苔的可能性較大。通過群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Y4 和FY9 的主要污染雜菌皆為蠟孔菌屬，因此推測蠟孔菌屬可能具有較強(qiáng)的繁殖能力，且具有抑制其他微生物生長的可能性。該現(xiàn)象與殷潔[29]等人對撕裂蠟孔菌的研究一致，在裂蠟孔菌HG2011 分泌水解酶中，纖維素酶和β-1，3-葡聚酶能降解病原真菌的細(xì)胞壁，磷酸酶和蛋白酶可水解病原真菌細(xì)胞膜，撕裂蠟孔菌HG2011 接觸辣椒疫霉菌絲后，辣椒疫霉菌絲發(fā)生變形、空泡化、斷裂和消融。因此，推測黑木耳菌棒污染的蠟孔菌也會對黑木耳菌絲產(chǎn)生類似的作用，但還需要進(jìn)一步研究。

黑木耳菌棒的污染與菌種的選擇、菌棒滅菌的溫度及壓力、與菌棒直接接觸的生產(chǎn)工人和生產(chǎn)工具有關(guān)[30]。還有可能是菌棒打孔接種后，在發(fā)菌期和出耳期直接與土壤和空氣接觸，導(dǎo)致染菌的現(xiàn)象發(fā)生。因此，應(yīng)嚴(yán)格控制生產(chǎn)環(huán)境、輔助添加天然殺菌劑等手段抑制微生物的生長和繁殖，才能保證黑木耳栽培的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。