岳萬松 劉紹雄 郭 相 余金鳳 張俊波 李雪松 羅孝坤*

（1云南云菌科技（集團(tuán)）有限公司，云南昆明650221；2云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南昆明650221；3中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明650221）

紫丁香蘑（Lepista nuda）隸屬白蘑科（Tricholomtaceae）、香蘑屬（Lepista）[1]。香蘑屬包含多種肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美的食用菌。紫丁香蘑是云南一種常見的野生食用菌，在歐洲受歡迎程度可比松茸、牛肝菌[2-3]。研究表明紫丁香蘑有潛在的抗氧化活性、抗菌活性及抗腫瘤活性，有廣泛的市場應(yīng)用前景[4-6]。但紫丁香蘑屬外生菌根菌[7]，人工栽培難度較大。近年來我國科研工作者對同屬中的花臉香蘑（L.sordida）人工馴化栽培研究較多，目前已取得較大突破[8-9]。而對紫丁香蘑的馴化研究僅在菌株分離鑒定、生物學(xué)特性、液體培養(yǎng)基及二級種篩選等方面[10-15]。已有研究表明，紫丁香蘑馴化栽培存在發(fā)菌速度慢、制種周期長、栽培周期長等問題[16-17]，這也成為制約紫丁香蘑規(guī)模化栽培的主要技術(shù)瓶頸。由此可見，快速擴(kuò)繁優(yōu)良的菌種是紫丁香蘑馴化栽培的關(guān)鍵步驟之一。目前，食用菌菌種生產(chǎn)多采用固體菌種逐級擴(kuò)繁，菌種生產(chǎn)周期長，且菌齡不一致。而液體菌種具有接種方便快速、發(fā)菌快、菌齡一致、制種周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[18-20]。

筆者對云南昆明采集的1株野生紫丁香蘑進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)種屬鑒定，分離得到純培養(yǎng)菌株，然后分別用其培養(yǎng)液體菌種和固體菌種制備栽培種，比較分析兩種制種方式流程和制種周期，最終篩選出一套快速而有效的紫丁香蘑栽培種制備技術(shù)，為紫丁香蘑的人工馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

2018 年11 月在云南昆明市阿子營采集到1 株野生紫丁香蘑（圖1a），組織分離獲得母種，保藏于昆明食用菌研究所菌種與資源研究中心，菌株編號為Z1。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g（煮沸過濾取汁），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加水至1 L。培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min。用于母種分離和保藏。

平皿菌種活化培養(yǎng)基：土豆200 g，胡蘿卜50 g，葡萄 糖 15 g，蔗 糖 5 g，黃 豆粉 30 g，蛋白胨 3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，瓊脂 15 g，加水至 1 L。土豆和胡蘿卜煮沸過濾取汁。培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min。

液體綜合培養(yǎng)基配方同菌種活化培養(yǎng)基，不加瓊脂粉，用于一、二級液體菌種或者發(fā)酵罐菌種的發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min。

原種、栽培種培養(yǎng)料配方：小麥59%，鋸末38%，蔗糖1%，石灰1%，普鈣1%，含水量均為60%～65%。原種培養(yǎng)料用650 mL廣口瓶裝料滅菌；栽培種培養(yǎng)料用聚丙烯塑料袋（12 cm×24 cm×0.005 cm）裝料滅菌。上述培養(yǎng)料121 ℃滅菌2 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

采集當(dāng)天參考文獻(xiàn)[2]和[7]完成對野生子實(shí)體（M1）的形態(tài)特征鑒定。

1.2.2 菌株分離

采用組織分離法在PDA 無菌平板上培養(yǎng)、純化（培養(yǎng)條件為28 ℃恒溫避光，單次培養(yǎng)時間為7～10 d）菌株，編號為Z1，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將分離菌株Z1 接種于活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d 后觀察記錄菌落特征、菌絲形態(tài)。組織分離的剩余新鮮子實(shí)體用硅膠干燥保存于無菌樣品袋內(nèi)，用于提取DNA。

1.2.3 分子鑒定

子實(shí)體M1 及其分離菌株Z1 總DNA 的提取均采用CTAB 提取法[21]，引物采用上海生工生物工程技術(shù)公司合成的通用引物 ITS1 和 ITS4[22]，50 μL 反應(yīng)體系和ITS 反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[23]完成。PCR 產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。將測得的ITS 序列用DNAMAN 進(jìn)行拼接，將ITS 序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對，獲得多條參考序列進(jìn)行多重對位排列，并手動去除排列結(jié)果中兩端的非對位排列區(qū)。用MEGA5.1 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3 栽培種制備

1.3.1 液體菌種擴(kuò)繁栽培種

將菌株Z1 的試管母種從4 ℃冰箱中取出并轉(zhuǎn)接到裝有活化培養(yǎng)基的平皿（直徑6 cm）中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為25 ℃恒溫避光，單次培養(yǎng)時間為11 d）。待菌絲長滿整個平皿，取10 塊平皿菌落（直徑為5 mm）轉(zhuǎn)至含有200 mL 液體綜合培養(yǎng)基的三角瓶（500 mL）中，置于搖床 160 r/min、25 ℃恒溫培養(yǎng)8 d，得到一級液體菌種。取45 mL 的一級液體菌種轉(zhuǎn)至含有800 mL 液體綜合培養(yǎng)基的三角瓶（1 L）中，置于電磁搖床上25 ℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)6 d，得到二級液體菌種。冷卻后取20 mL二級液體菌種接入固體栽培種培養(yǎng)料袋，培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲滿袋，觀察記錄菌絲生長情況。3 個重復(fù)，每個重復(fù)100袋。

1.3.2 固體菌種擴(kuò)繁栽培種

母種擴(kuò)繁同1.3.1。取3 塊平皿菌落（約3 cm2）接入原種培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)至滿瓶，觀察記錄菌絲生長情況。再取20 g原種接入栽培種培養(yǎng)料中，培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲滿袋，觀察記錄菌絲生長情況。3個重復(fù)，每個重復(fù)100袋。

圖1 M1子實(shí)體及分離培養(yǎng)菌絲形態(tài)特征

2 結(jié)果與分析

2.1 M1菌株的形態(tài)特征及分離培養(yǎng)結(jié)果

采集野生菌株M1 子實(shí)體中等大小，菌蓋直徑3.5～10 cm，半球形至平展，亮紫色、丁香紫色至紫色，光滑，濕潤，邊緣內(nèi)卷，無條紋。菌肉淡紫色，較厚。菌褶紫色，直生至稍延生，邊緣往往呈小鋸齒狀。菌柄長4～9 cm，粗0.5～2 cm，圓柱形，色同菌蓋，初期上部有絮狀粉末，下部光滑或具有縱條紋，內(nèi)實(shí)，基部稍膨大（圖1a、b）。分離菌株Z1菌絲在活化培養(yǎng)基上呈淡紫色，輻射狀生長，后期會形成大量氣生菌絲，大約11 d 左右菌絲可長滿整個平皿（圖1c）；其菌絲壁薄，分枝較多，存在大量的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)（圖1d）。

綜合以上特征，M1菌株具有顯著香蘑屬真菌特征，確定其為香蘑屬真菌。

2.2 菌株分子鑒定結(jié)果

通過PCR 擴(kuò)增和ITS 序列測定，獲得子實(shí)體M1及其分離菌株Z1 的ITS 序列，其ITS 序列長度分別為610 bp、608 bp。ITS序列聚類分析結(jié)果表明，M1、Z1 與NCBI 庫里的多個菌株共聚為4 個類群，其中M1、Z1 與L.nudaLC370442 菌株的序列相似性高達(dá)100%（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定，將M1、Z1 鑒定為紫丁香蘑（Lepista nuda）。

2.3 液體菌種、固體菌種擴(kuò)繁栽培種結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，紫丁香蘑固體原種培養(yǎng)需30 d，從一級液體菌種到二級液體菌種共需14 d。將固體原種接入培養(yǎng)料后菌絲發(fā)滿菌袋需要47 d，而將液體菌種接入培養(yǎng)料只需41 d 即可滿袋。從制種周期來看，傳統(tǒng)的固體菌種（圖3）需要逐級擴(kuò)繁母種、原種、栽培種，平均需88 d，而用液體菌種（圖4）平均只需66 d，縮短22 d，制種效率顯著提高。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 液體菌種擴(kuò)繁栽培種

圖4 固體菌種擴(kuò)繁栽培種

3 小結(jié)與討論

香蘑屬真菌的種間形態(tài)相似性較高，單靠傳統(tǒng)的分類學(xué)方法鑒定容易出現(xiàn)同名異物或同物異名的現(xiàn)象。因此目前多采用形態(tài)學(xué)分類和分子鑒定相結(jié)合的方法來確定菌株種屬歸類[10-11]。對M1 及其分離菌株Z1 形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS 序列分析鑒定，兩種方法的鑒定結(jié)果一致并相互印證，確定M1、Z1 為紫丁香蘑（Lepista nuda）。

菌種擴(kuò)繁試驗(yàn)結(jié)果表明，采用液體菌種擴(kuò)繁紫丁香蘑栽培種，相比用固體原種擴(kuò)繁，制種周期明顯縮短。因此，液體轉(zhuǎn)固體制種的方法對紫丁香蘑人工馴化栽培具有較好的實(shí)用價(jià)值。

今后應(yīng)擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模，并進(jìn)行紫丁香蘑覆土栽培試驗(yàn)。