紀(jì)純陽(yáng)

（遼寧省楊樹研究所，遼寧營(yíng)口115213）

美味牛肝菌（Boletus edulis）為牛肝菌科（Boletaceae）中的一種[1]，也是一種食藥兼用經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的真菌，全國(guó)各地均有分布[2]。美味牛肝菌含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，人體必需的多種氨基酸、維生素及微量元素，有防病治病、強(qiáng)身健體的功效[3]。液體培養(yǎng)菌絲體生長(zhǎng)快，生產(chǎn)周期短，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，菌絲體在保健食品開發(fā)或提取多糖等方面具有很好的應(yīng)用前景[4，5]。目前國(guó)內(nèi)的大多數(shù)研究主要集中在對(duì)牛肝菌多糖的發(fā)酵、提取和生物活性物質(zhì)開發(fā)等方面，但這些研究都是以液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲為基礎(chǔ)，因此筆者進(jìn)行了美味牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究，以期為美味牛肝菌的生產(chǎn)及其食（藥）用價(jià)值的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)菌株：美味牛肝菌，購(gòu)自中國(guó)微生物研究所菌種保藏中心，編號(hào)5.504。

（2）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖5 g，麥芽糖22 g，酵母膏14 g，硫酸銨2.7 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸亞鐵67 mg，硫酸銅100 μg，加蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的平板培養(yǎng)[6-7]

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂即得到固體培養(yǎng)基，將分離的美味牛肝菌菌株用打孔器（直徑10 mm）打孔，將獲得菌絲碟接種于固體培養(yǎng)基上，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基面時(shí)放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)[8，9，10]

選取菌絲生長(zhǎng)均勻的平皿，用無(wú)菌打孔器（直徑10 mm）打孔，無(wú)菌鑷子夾取一片菌絲碟接種于盛有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)。分別測(cè)定每天菌絲干重：用漏斗過(guò)濾發(fā)酵液，保留的菌絲于40 ℃的烘箱中烘干稱重，即為菌絲的干重。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)作生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 美味牛肝菌搖床發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)[11-12]

碳源：分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉作培養(yǎng)基中的碳源，使含碳量同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其余成分不變。

氮源：分別用硫酸銨、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、黃豆粉和尿素作培養(yǎng)基中的氮源，使含氮量同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其余成分不變。

無(wú)機(jī)鹽：基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，加入不同濃度的磷酸二氫鉀，使其濃度（g/L）依次為：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1，其余成分不變。

由于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵和硫酸銅含量較少，不做分析。發(fā)酵培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min，pH4.1，裝液量100 mL。

每個(gè)試驗(yàn)4次重復(fù)。液體發(fā)酵培養(yǎng)至菌絲量最大的時(shí)期，測(cè)其發(fā)酵液中美味牛肝菌菌絲干重。采用DPS18.10高級(jí)版軟件，LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)[13-14]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)美味牛肝菌生長(zhǎng)影響顯著的三組碳源、氮源與三個(gè)水平的磷酸二氫鉀進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 美味牛肝菌發(fā)酵培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)曲線[15]

由圖1 可以看出，供試美味牛肝菌菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)2 d菌絲進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 d達(dá)到最高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，持續(xù)1 d 后進(jìn)入衰老期，因此5 d 是美味牛肝菌菌絲最佳的培養(yǎng)時(shí)間。

圖1 美味牛肝菌液體發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)曲線

2.2 美味牛肝菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果[16，17，18]

2.2.1 供試碳源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖2 試驗(yàn)碳源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖2 可見(jiàn)，試驗(yàn)7 種碳源均可被美味牛肝菌菌絲利用，以葡萄糖+麥芽糖混合碳源，菌絲干重最高（6.118 g/L），其次為蔗糖、葡萄糖，而乳糖作為碳源菌絲干重最低（4.498 g/L）。

2.2.2 供試氮源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖3 可見(jiàn)，試驗(yàn)7 種氮源均能被美味牛肝菌菌絲利用，但菌絲干重有明顯差異，其中以黃豆粉作為氮源時(shí)菌絲干重最高（5.905 g/L），其次是酵母膏、酵母膏＋硫酸銨，而用尿素作為氮源菌絲干重最少（4.798 g/L）。

圖3 試驗(yàn)氮源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2.3 KH2PO4含量對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖4 KH2PO4含量對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖4 可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中KH2PO4含量低于0.5 g/L 時(shí)，菌絲干重隨著KH2PO4含量上升而增加，KH2PO4含量為0.5 g/L 時(shí)菌絲干重最高，為5.608 g/L。之后隨著KH2PO4含量的增加菌絲干重反而降低。

2.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

由表2 可知，各因素對(duì)美味牛肝菌菌絲干重的影響程度依次為B＞C＞A，最佳組合為A1B2C2，即選用葡萄糖＋麥芽糖作為碳源、酵母膏＋硫酸銨作為氮源、0.5 g/L 磷酸二氫鉀作為無(wú)機(jī)鹽。培養(yǎng)基中氮源的含量對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)影響最大。

3 小結(jié)與討論

單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果，美味牛肝菌發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖5 g/L，麥芽糖22 g/L，酵母膏14 g/L，硫酸銨2.7 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵67 mg/L，硫酸銅100 μg/L。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)在此條件下的菌絲干重為6.214 g/L。

試驗(yàn)最大的特點(diǎn)是選用組合的碳源及氮源，更利于美味牛肝菌菌絲的生長(zhǎng)。組合碳源為葡萄糖+麥芽糖。葡萄糖是一種速效碳源，能夠被菌絲體直接利用，縮短菌絲生長(zhǎng)延滯期的時(shí)間，但其組成成分較單一，不利于菌絲體在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)和大規(guī)模生產(chǎn)；麥芽糖是一種二糖，只有在菌絲體分泌的胞外酶的作用下降解成單糖時(shí)，才能被利用，有利于菌絲的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。氮源是構(gòu)成菌絲體氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸的重要物質(zhì)，通常所用的氮源可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮兩類。大部分真菌能很好地利用有機(jī)氮，吸收少量的無(wú)機(jī)氮。試驗(yàn)采用酵母膏＋硫酸銨作為氮源更利于菌絲的生長(zhǎng)。真菌菌絲生長(zhǎng)需要少量的無(wú)機(jī)鹽、微量元素，有的是細(xì)胞的重要組成成分，有的在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性和酶活性方面起重要的作用。

培養(yǎng)基的組成和配比合適與否，對(duì)微生物生長(zhǎng)，生物產(chǎn)量及其活性成分提煉工藝的選擇及質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。試驗(yàn)獲得了美味牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，為美味牛肝菌馴化栽培及其開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。