水志杰,安沛沛,劉天相,吳洪啟,劉 樂,史 雪,王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

麥穗是小麥籽粒的唯一載體，小麥穗長(zhǎng)與小穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重等產(chǎn)量性狀緊密相關(guān)。有小麥育種家指出，要將穗長(zhǎng)作為小麥品種培育過程中的重要衡量指標(biāo)進(jìn)行研究和利用，在考種環(huán)節(jié)中要將小麥穗長(zhǎng)作為一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)量和分析[1-2]。曹 東等[3]以兩個(gè)人工合成小麥改良品種構(gòu)建的F2群體為試驗(yàn)材料，在2D、3B和5B染色體上定位到4個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL；侯立江[4]以普通小麥和超小穗小麥為親本構(gòu)建的F2群體為試驗(yàn)材料，檢測(cè)到8個(gè)加性QTL，并認(rèn)為其中位于3A染色體上的QTL很可能控制穗長(zhǎng)性狀。前人的研究?jī)?nèi)容多集中于小麥穗長(zhǎng)性狀，卻對(duì)控制穗長(zhǎng)的基因少有報(bào)道。宋 楠[5]對(duì)冰草不同性狀進(jìn)行研究，指出穗寬與小穗數(shù)緊密相關(guān)，但關(guān)于小麥穗寬性狀的研究鮮有報(bào)道。因此，通過構(gòu)建超高密度遺傳圖對(duì)小麥穗長(zhǎng)、穗寬性狀進(jìn)行研究仍有必要。

隨著育種進(jìn)程的不斷推進(jìn)，優(yōu)勢(shì)基因被重復(fù)利用，使得普通小麥的遺傳多樣性愈發(fā)狹窄[6]。山羊草作為普通小麥的祖先種之一，具有抗病、抗蟲和抗旱等特征，而人工合成小麥則是由四倍體硬粒小麥(Triticumdicoccoides，AABB)與山羊草(Aegilopstauschii，DD)經(jīng)人工雜交創(chuàng)制而成。人工合成小麥與普通六倍體小麥(TriticumaestivumL.,AABBDD)雜交，可以將人工合成小麥中的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中[7]，是利用野生基因資源的重要橋梁[8]。挖掘利用人工合成小麥的優(yōu)異基因，對(duì)拓寬現(xiàn)代小麥育種基因資源，豐富小麥遺傳多樣性具有重要意義。自20世紀(jì)90年代，國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)利用山羊草和硬粒小麥創(chuàng)制人工合成小麥以來，使用人工合成小麥對(duì)普通小麥進(jìn)行遺傳改良，已成為許多國(guó)家小麥育種工作的重要內(nèi)容[9]。張 颙等[10-11]在研究中指出，利用來自CIMMYT的人工合成小麥與本地普通小麥經(jīng)雜交選育的川麥42與川麥38具有高產(chǎn)、高抗的優(yōu)良特性，對(duì)普通小麥的品種改良和培育極具指導(dǎo)意義。

本試驗(yàn)以人工合成小麥和普通小麥為親本構(gòu)建了F7∶8RIL群體，基于小麥55K SNP芯片對(duì)F7RIL群體構(gòu)建遺傳圖譜，對(duì)穗長(zhǎng)和穗寬性狀進(jìn)行QTL定位及遺傳分析，為挖掘新的基因位點(diǎn)以及利用人工合成小麥對(duì)栽培種小麥進(jìn)行遺傳改良提供參考，同時(shí)也為進(jìn)一步開展對(duì)目標(biāo)性狀的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料包括人工合成小麥KU98、普通栽培小麥西農(nóng)389以及由西農(nóng)389 × KU98創(chuàng)制的包含152個(gè)F7∶8重組自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群體，由西北農(nóng)林科技大學(xué)胡銀崗教授提供。其中，KU98的穗子長(zhǎng)而窄，西農(nóng)389的穗子短而寬(圖1)，KU98由來自伊朗的粗山羊草(代號(hào)KU-2098)與四倍體硬粒栽培種小麥品種Langdon雜交獲得。

圖1 西農(nóng)389和KU98的穗部性狀

1.2 方 法

1.2.1 田間種植及性狀調(diào)查

2017年(F7)和2018年(F8)分別將RIL群體及其親本種植在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗(yàn)田。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置三次重復(fù)，每株系種植1行，行長(zhǎng) 1 m，行距 25 cm，株距 10 cm。于小麥成熟后，分別從每個(gè)株系中選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥，對(duì)其主莖的穗長(zhǎng)和穗寬進(jìn)行測(cè)量，穗長(zhǎng)的測(cè)量值為穗柄至穗尖的長(zhǎng)度，穗寬的測(cè)量值為最寬小穗的寬度，均以直尺進(jìn)行測(cè)量，穗長(zhǎng)和穗寬的測(cè)量值均不包含芒長(zhǎng)。

1.2.2 DNA樣品制備

取F7∶8RIL群體及2個(gè)親本苗期葉片，采用CTAB法[12]提取DNA，使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，利用微量核酸測(cè)定儀(NanoDrop One，Thermo ScientificTM)檢測(cè)DNA 濃度。

1.2.3 芯片數(shù)據(jù)分析

小麥55K SNP芯片分型分析及樣品質(zhì)檢工作由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成，小麥55K SNP芯片包含53 063個(gè)SNP標(biāo)記，覆蓋小麥的21對(duì)染色體。采用Genomestudio v1.0 軟件進(jìn)行多態(tài)性分析獲得基因型數(shù)據(jù)后，在兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，根據(jù)QTL IciMapping V4.1作圖軟件(www.isbreeding.net)對(duì)基因型數(shù)據(jù)格式的要求，在RIL群體中分別將與母本相同的標(biāo)記記為0，與父本相同的標(biāo)記記為2，將分型失敗的標(biāo)記記為-1，雜合基因型記為1。

1.2.4 表型數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016對(duì)F7∶8RIL群體穗長(zhǎng)和穗寬的表型值進(jìn)行匯總和均一化處理，利用IBM SPSS Statistics 18數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)穗長(zhǎng)和穗寬的表型值進(jìn)行方差分析及正態(tài)分布檢驗(yàn)。

1.2.5 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

基于小麥55K SNP芯片分型結(jié)果與表型分析結(jié)果，利用QTL IciMapping 4.1軟件對(duì)RIL群體各株系的基因型進(jìn)行遺傳連鎖分析并作圖，利用Kosambi作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM)[13]。在此基礎(chǔ)上，使用軟件的BIN程序以20%為缺失率(missing rate)的閾值去除缺失率較高的標(biāo)記及冗余標(biāo)記，使用MAP功能對(duì)SNP標(biāo)記進(jìn)行分析并繪制遺傳連鎖圖，默認(rèn)掃描步長(zhǎng)為1 cM，顯著檢驗(yàn)水平為0.05，排列檢驗(yàn)次數(shù)為1 000，利用SDL功能對(duì)參與作圖的標(biāo)記進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)RIL作圖群體是否符合理論分離比率(1∶1)[14]，在BIP功能程序中默認(rèn)LOD為2.5，選擇完備區(qū)間作圖法(ICIM-ADD)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行QTL定位和加性遺傳效應(yīng)分析。最后使用Map Chart 2.2繪制遺傳連鎖圖及中國(guó)春小麥參考基因組物理圖譜(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)。

QTL命名方式參考Mccouch等[15]的方法，即QTL + 性狀英文名稱+ 染色體英文名稱 + QTL數(shù)目，其中所有名稱均使用英文縮寫表示，如qSL-1A.1表示位于1A染色體上第1個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL。如果QTL的表型變異解釋率(PVE%)大于10%，則認(rèn)為該QTL為主效QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F7∶8 RIL群體性狀變異分析

由表1可知，2018和2019年，父本KU98的穗長(zhǎng)分別為13.78 cm和14.84 cm，穗寬分別為0.70 cm和0.92 cm，母本西農(nóng)389的穗長(zhǎng)分別為8.92 cm和9.08 cm，穗寬分別為1.60 cm和 1.64 cm。t檢驗(yàn)表明穗長(zhǎng)和穗寬性狀在父、母本間具有極顯著差異。對(duì)2018和2019年RIL群體穗長(zhǎng)和穗寬性狀的表型值分別進(jìn)行單樣本 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，P值(K-S檢驗(yàn)值)均大于0.05，說明目標(biāo)性狀在F7∶8RIL群體中呈連續(xù)分布，且符合正態(tài)分布(表1、圖2)。因此，可以利用此RIL群體對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行QTL定位 分析。

表1 親本及RIL群體表型變異分析Table 1 Phenotypic variation in parents and RIL population

2.2 高密度遺傳連鎖圖構(gòu)建及分析

本研究所使用的小麥55K SNP芯片由小麥660K SNP芯片優(yōu)化而來?；谛酒中偷慕Y(jié)果，對(duì)親本(西農(nóng)389×KU98)進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，共得到23 785個(gè)純合的多態(tài)性標(biāo)記，利用QTL IciMapping軟件對(duì)F7RIL群體全部株系的標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建，使用軟件的BIN功能去除冗余標(biāo)記后，共獲得4 831個(gè)參與遺傳圖譜構(gòu)建的標(biāo)記。

利用本試驗(yàn)群體所構(gòu)建的遺傳圖譜包含26個(gè)連鎖群，覆蓋小麥21條染色體，全基因組總遺傳距離為7 960.26 cM，平均標(biāo)記密度為1.65 cM。2D染色體存在最大的連鎖群，由327個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)成，長(zhǎng)度為609.18 cM；7B染色體存在一個(gè)最小連鎖群，由6個(gè)SNP標(biāo)記組成，標(biāo)記區(qū)間長(zhǎng)度為13.2 cM，平均標(biāo)記密度為2.20 cM。A、B、D三個(gè)亞基因組的標(biāo)記數(shù)目分別為1 647、 1 707和1 477個(gè)(表2)。構(gòu)建遺傳圖譜的群體基因型標(biāo)記經(jīng)過軟件SDL程序的卡方檢驗(yàn)(2)后，其親本基因型在群體中的分離比分別為 1∶1.11，接近理論分離比1∶1，符合遺傳作圖的要求。

表2 高密度遺傳圖譜信息Table 2 Summary of high-density linkage map

A和C分別表示F7 RIL群體穗長(zhǎng)和穗寬性狀的表型頻率分布；B和D分別表示F8 RIL群體穗長(zhǎng)和穗寬性狀的表型頻率分布。

2.3 小麥穗長(zhǎng)及穗寬性狀的QTL定位及分析

基于已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜和兩年的表型數(shù)據(jù)對(duì)RIL群體的穗長(zhǎng)和穗寬性狀進(jìn)行加性QTL分析，結(jié)果見表3和圖3。

2018年檢測(cè)到3個(gè)與穗長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL，分別位于2D、5A和7B染色體上，其加性效應(yīng)均為正值。2019年檢測(cè)到7個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別位于1A、2D、3A、5A和7B染色體，除qSL-1A.1和qSL-7B.3外，其余位點(diǎn)加性效應(yīng)均為正值，其中，3個(gè)主效QTL的貢獻(xiàn)率大于10%，分別為qSL-1A.2、qSL-5A.2和qSL-7B.2，對(duì)應(yīng)的標(biāo)記區(qū)間分別為AX-110944881～AX-111592607、AX-108792246-AX～111048027和AX-111650139～AX-110087763，LOD值分別為16.35、16.68和18.00。

2018年檢測(cè)到6個(gè)與穗寬性狀相關(guān)的QTL，分別位于2D、4D、5A、6A和7D染色體上，其中，qSW-2D.1和qSW-5A.1均為主效QTL，分別位于2D和5A染色體上，標(biāo)記區(qū)間分別為AX-89728114～AX-109842248、AX-108792246～AX-111048027，LOD值分別為9.54和13.94，貢獻(xiàn)率分別為10.16%和16.38%。2019年檢測(cè)到4個(gè)與穗寬相關(guān)的QTL，分別位于2D、4D、5A和7D染色體上，位于5A染色體上的qSW-5A.1為主效QTL，標(biāo)記區(qū)間為AX-108792246～ AX-111048027，貢獻(xiàn)率為26.25%，LOD值為14.74，檢測(cè)到的所有與穗寬性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)均為負(fù)值。

為了對(duì)定位結(jié)果進(jìn)行綜合分析及方便與前人研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì)檢驗(yàn)，將本研究中穗長(zhǎng)和穗寬性狀的定位結(jié)果與普通小麥中國(guó)春的物理圖譜進(jìn)行比對(duì)。由于連鎖群及其標(biāo)記過多，故僅選取1A、2D、4D、5A和7B連鎖群10%～20%的標(biāo)記在Map Chart軟件中進(jìn)行繪圖(表3、圖3)。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的主效QTL(qSL-1A.2、qSL-5A.2、qSL-7B.2)分別位于1A染色體的51 966.53～54 498.55 kb區(qū)間、5A染色體的646 360.11～651 554.41 kb區(qū)間和7B染色體的12 587.55～12 966.27 kb區(qū)間。兩個(gè)與穗寬相關(guān)的主效QTL(qSW-2D.1、qSW-5A.1)分別位于2D染色體的23 102.53～26 344.37 kb區(qū)間和5A染色體的646 360.11～651 554.41 kb區(qū)間。此外，比對(duì)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，位于2D染色體的4個(gè)QTL分布較為集中，其中qSL-2D.1兩年定位區(qū)間均位于2D染色體的30 493.66～ 31 582.96 kb區(qū)間，標(biāo)記區(qū)間均為AX-111939856～AX-111497351，說明qSL-2D.1是一個(gè)穩(wěn)定的微效QTL；qSW-2D.1和qSW-2D.2在連鎖圖譜和物理圖譜的分布較近，認(rèn)為在2D染色體的15 433.40～21 554.25 kb區(qū)間存在與穗寬相關(guān)的QTL。位于4D和5A染色體的qSW-4D.1(位于4D染色體的439 696.45～439 870.27 kb區(qū)間)和qSW-5A.1兩年間的定位結(jié)果一致，說明qSW-4D.1和qSW-5A.1分別是穩(wěn)定的微效QTL和主效QTL。而位于7B染色體的qSL-7B.2的物理區(qū)間與qSL-7B.1(位于7B染色體的11 725.56～13 704.17 kb)完全重疊，且qSL-7B.2與qSL-7B.1標(biāo)記區(qū)間的遺傳距離較近(4.12 cM)，認(rèn)為兩者為同一位點(diǎn)。

表3 2018和2019年穗長(zhǎng)和穗寬性狀的加性QTL分析Table 3 Additive QTL analysis of spike length and spike width in 2018 and 2019

3 討 論

作圖群體親本的選配是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)，親本間的遺傳差異與定位結(jié)果的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)[16]。本研究中RIL群體的母本西農(nóng)389由多個(gè)親本經(jīng)復(fù)交和有限回交選育而成，遺傳基礎(chǔ)豐富，父本KU98由硬粒小麥和山羊草經(jīng)人工雜交創(chuàng)制而成，兩者的遺傳背景差異明顯，為進(jìn)行有效地QTL定位奠定良好基礎(chǔ)，同時(shí)RIL群體可以作為永久作圖群體繼續(xù)進(jìn)行多年多點(diǎn)的QTL檢測(cè)。

遺傳圖譜是QTL定位和遺傳分析的重要工具。本研究使用商業(yè)化的小麥55K SNP芯片對(duì)F7∶8RIL作圖群體進(jìn)行掃描，構(gòu)建了包含4 831個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖譜，父母本基因型在作圖群體中的分離比為1∶1.11，接近理論遺傳分離比，說明群體在人工選擇構(gòu)建的過程中未出現(xiàn)偏分離，A、B、D三個(gè)亞基因組的標(biāo)記分別為1 647、1 707和1 477個(gè)。崔德周等[17]基于90K SNP芯片對(duì)萊州953 ×山農(nóng)輻63組合構(gòu)建的F2群體進(jìn)行遺傳圖譜繪制，其標(biāo)記數(shù)目在基因組的分布為B>A>D，與本研究標(biāo)記分布趨勢(shì)一致。而崔德周等[17]的研究結(jié)果指出，標(biāo)記數(shù)目在三個(gè)基因組的分布并不平衡，但在本研究中三個(gè)亞基因組的標(biāo)記數(shù)目接近，造成這一差異的原因是本研究使用的小麥55K SNP芯片與90K SNP芯片標(biāo)記分布不同。55K和90K SNP芯片是我國(guó)目前主流的小麥商用芯片，90K SNP主要面向歐美小麥品種進(jìn)行設(shè)計(jì)，且其硬粒小麥和山羊草等近緣種的SNP標(biāo)記只有十分之一左右，標(biāo)記在基因組的分布并不平衡。而55K芯片標(biāo)記SNP由660K芯片經(jīng)優(yōu)化篩選而來，其標(biāo)記A、B、D基因組的分布更為均勻，作為高密度的經(jīng)濟(jì)優(yōu)惠型芯片，更加適合對(duì)中國(guó)小麥進(jìn)行多樣本檢測(cè)。

穗長(zhǎng)性狀與穗粒數(shù)關(guān)系密切[18]，間接影響小麥產(chǎn)量。前人對(duì)小麥穗長(zhǎng)性狀的研究報(bào)道指出，小麥穗長(zhǎng)性狀相關(guān)QTL在1AS、1BL、2A、2BL、2DL、3A、3B、4B、5B和7A等多條染色體均存有分布[19-22]。武炳瑾等[23]利用周 8425B與小偃81雜交構(gòu)建的F8RIL群體和90K SNP芯片在三個(gè)環(huán)境條件中共檢測(cè)到18個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分布于1A、1D、2B、2D、3A、3B、4A、5B、6A、6B、7A、7B 和 7D 染色體上，包含9個(gè)主效QTL，其中qSL.NAFU-6A.2和qSL.NAFU-7A是位于6A和7A染色體的環(huán)境穩(wěn)定性主效QTL。李 聰?shù)萚23]利用55K SNP芯片和普通小麥構(gòu)建的F6 RIL群體經(jīng)過多年多點(diǎn)試驗(yàn)，檢測(cè)到27個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL，分布于1A、1D、2B、2D、3A、4A、4B、5A、5B、6A和7D染色體，其中共檢測(cè)到4個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的穩(wěn)定主效QTL，分別位于2D和4B染色體。其中，qSL-SAU-2D.1的標(biāo)記區(qū)間為AX-111096297～AX-109422526，其物理位置在2D染色體上32.97 Mb處，與本研究中qSL-2D.1的物理區(qū)間(2D染色體的30 493.66～ 31 582.96 kb)比較接近，推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)之間存在與穗長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL。本研究連續(xù)兩年在2D、5A和7B染色體檢測(cè)到穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL，其中qSL-2D.1兩年檢測(cè)到的標(biāo)記區(qū)間一致，qSL-7B.1與qSL-7B.2的標(biāo)記區(qū)緊密相鄰，并且兩者的物理區(qū)間重疊，所以認(rèn)為qSL-7B.1與qSL-7B.2為同一位點(diǎn)。本研究中與穗長(zhǎng)性狀相關(guān)的穩(wěn)定QTLqSL-2D.1與李 聰?shù)萚24]的定位結(jié)果相同，而與武炳瑾等[23]的研究結(jié)果存在一定差異，推測(cè)造成這種差異的原因有兩點(diǎn)，一是本研究中作為父本的人工合成小麥遺傳背景與普通小麥不同，二是本研究還缺少對(duì)目標(biāo)性狀多點(diǎn)環(huán)境下的檢測(cè)。武炳瑾等[23]對(duì)檢測(cè)到的與穗長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL進(jìn)行加性效應(yīng)分析，認(rèn)為穗長(zhǎng)性狀的有利變異來源于父本(小偃81)，該觀點(diǎn)與本研究的分析結(jié)果一致。

F7群體QTL定位結(jié)果用藍(lán)色表示；F8群體QTL定位結(jié)果用紅色表示。

穗寬作為穗部性狀之一，宋 楠[5]在對(duì)小麥近緣種之一的冰草進(jìn)行了多個(gè)性狀的研究分析，指出穗寬與小穗數(shù)具有正相關(guān)關(guān)系，說明穗寬也會(huì)對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生影響。而目前對(duì)小麥穗寬性狀的QTL定位研究鮮有報(bào)道，本研究經(jīng)過連續(xù)兩年的表型調(diào)查統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)兩年間均檢測(cè)到與穗寬性狀相關(guān)的qSW-4D.1與qSW-5A.1，表明它們是可靠的QTL位點(diǎn)，且qSW-5A.1兩年的貢獻(xiàn)率分別高達(dá)16.38%和26.25%，是一個(gè)穩(wěn)定的主效QTL，此外，qSW-5A.1與qSL-5A.2標(biāo)記區(qū)間相同，推測(cè)該位點(diǎn)具有一因多效的遺傳效應(yīng)或連鎖遺傳關(guān)系，該研究結(jié)果為穗寬性狀的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。