尚恒 馬金剛 魏紅麗 楊華 范斌 路林峰

甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)屬于破壞性抗體，其滴度水平反映了甲狀腺內淋巴細胞浸潤及甲狀腺自身免疫損傷的程度，是橋本甲狀腺炎(HT)的標志性抗體[1]。促甲狀腺素受體抗體(TRAb)是Graves病(GD)的致病性抗體，但GD患者中TPOAb的陽性率高達80%左右[2]。且伴有高水平TPOAb的GD患者給予抗甲狀腺藥物治療后易出現(xiàn)早發(fā)甲狀腺功能減退(簡稱甲減)[3]，輔助性T淋巴細胞(Th)17、調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)參與了甲狀腺組織自身免疫損傷，Th17/Treg細胞免疫失衡在HT的發(fā)生發(fā)展及TPOAb等甲狀腺自身抗體的產生中發(fā)揮重要作用[4]。我們通過分析TPOAb陽性的GD患者Th17、Treg水平及兩者比值的變化，探討Th17/Treg細胞免疫失衡在GD患者TPOAb產生中的作用。

對象與方法

1.對象：選取2017年12月～2018年6月就診于我院的GD患者160例，均為初發(fā)GD且未經治療。GD診斷標準：(1)高代謝的癥狀和體征；(2)觸診及超聲檢查結果顯示甲狀腺彌漫性腫大；(3)血清總甲狀腺素(TT4)、游離甲狀腺素(FT4)水平增高，促甲狀腺激素(TSH)水平降低；(4)眼球突出和其他浸潤性眼征；(5)脛前黏液性水腫；(6)TRAb、甲狀腺刺激性抗體(TSAb)、TPOAb陽性；以上(1)～(3)項為診斷必備條件，(4)～(6)項為診斷輔助條件。排除其他自身免疫性疾病及合并腫瘤、妊娠的患者。其中男36例，女124例，年齡15～79歲，平均年齡(32.38±6.36歲)歲。根據(jù)TPOAb水平將納入患者分為4組：TPOAb陰性組(TPOAb≤35 IU/ml)32例、TPOAb輕度升高組(35 IU/ml500 IU/ml)20例。另選取同期我院健康體檢者20例作為對照組，其中男5例，女15例，年齡20～47歲，平均年齡(32.51±6.27)歲。本研究經我院倫理委員會審批通過。

2.方法

(1)標本采集及相關指標檢測：抽取受試者空腹外周靜脈血5 ml，檢測其甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體及細胞因子水平。采用化學發(fā)光法檢測FT3、FT4、TSH水平，檢測設備為羅氏Cobas e601型電化學發(fā)光分析儀。采用免疫化學發(fā)光法檢測TRAb、TPOAb水平，檢測設備為美國Beckman coulter分析儀。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清轉化生長因子(TGF)-β、白細胞介素(IL)-17水平，試劑盒購自美國R&D公司，按照試劑盒操作說明進行檢測。

(2)Treg和Th17檢測：抽取所受試者的空腹外周血5 ml，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，調整細胞密度為1×106/ml，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中進行Treg和Th17的檢測。①Treg檢測：收集PBMC，加入藻紅蛋白(PE)-抗人CD4單克隆抗體、PE-抗人CD25-藻藍蛋白(APC)進行細胞表面染色、PE-抗人Foxp3單克隆抗體(均購自美國eBioscience公司)進行細胞內因子染色，采用流式細胞儀(BD FACS Calibur)進行檢測分析。②Th17檢測：將PBMC懸液置于24孔培養(yǎng)板內，每孔加入25 ng/ml佛波酯(美國Alexis公司)200 μl和1 μg/ml伊諾霉素(美國Alexis公司)200 μl后，在37 ℃孵育箱中培養(yǎng)4小時，收集細胞，加入PE-抗人CD4單克隆抗體進行細胞表面染色、PE-抗人IL-17A單克隆抗體進行細胞內因子染色，采用流式細胞儀進行檢測分析。應用CellQuest軟件進行數(shù)據(jù)分析，以CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞表示Treg比例，CD4+IL-17A+T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞表示Th17比例。

結 果

1.5組受試者一般資料、甲狀腺功能及TRAb水平比較：5組受試者的年齡和性別構成兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4組GD患者的FT3、FT4和TRAb水平均明顯高于對照組，TSH水平明顯低于對照組(P<0.05)。其中TPOAb重度升高組的FT4和TRAb水平明顯高于其余3組GD患者(P<0.05)，且這3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4組GD患者的FT3和TSH水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組受試者一般資料、甲狀腺功能及TRAb水平比較

2.5組受試者Th17和Treg表達及Th17/Treg比值比較：4組GD患者的Th17表達及和Th17/Treg比值均明顯高于對照組，且TPOAb重度升高組明顯高于其余3組GD患者，TPOAb中度升高組明顯高于TPOAb陰性組和TPOAb輕度升高組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TPOAb陰性組與TPOAb輕度升高組的Th17表達和Th17/Treg比值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4組GD患者的Treg表達均低于對照組(P<0.05)，但各GD組患者兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組受試者Th17和Treg表達及Th17/Treg比值比較

3.5組受試者IL-17和TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較：4組GD患者的IL-17水平和IL-17/TGF-β比值均明顯高于對照組，且TPOAb重度升高組明顯高于其余3組GD患者，TPOAb中度升高組明顯高于TPOAb-陰性組和TPOAb輕度升高組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TPOAb陰性組與TPOAb輕度升高組IL-17水平和IL-17/TGF-β比值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4組GD患者TGF-β水平均明顯高于對照組(P<0.05)，但各GD組患者兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組受試者IL-17和TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較

討 論

TPOAb是一種免疫球蛋白G，可與甲狀腺素合成過程中的關鍵酶甲狀腺過氧化物酶發(fā)揮協(xié)同作用，從而抑制甲狀腺激素的合成，導致甲減。TPOAb可反映甲狀腺濾泡細胞破壞的程度和自身免疫狀態(tài)，是HT的標志性抗體[5]。GD為一種器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)生發(fā)展與細胞免疫及體液免疫異常關系密切，TRAb是其致病性抗體，而GD伴TPOAb水平升高可能與甲狀腺內淋巴細胞的浸潤導致甲狀腺細胞主要組織相容性復合物(MHC)-Ⅱ類抗原表達增加，甲狀腺過氧化物酶釋放入血產生抗原抗體反應有關[6]。

本研究根據(jù)TPOAb水平升高程度對GD患者進行分組研究發(fā)現(xiàn)，TPOAb重度升高GD患者的FT4和TRAb水平均明顯高于TPOAb陰性及輕、中度升高TPOAb患者。任麗萍等[7]通過病理研究證實，甲狀腺內淋巴細胞浸潤程度與血清TPOAb滴度存在明顯相關性，表明TPOAb滴度重度升高患者的甲狀腺內淋巴細胞浸潤程度較嚴重，細胞免疫及體液免疫炎性反應劇烈。而FT4、TRAb水平可以直接反映甲狀腺細胞功能亢進程度及疾病活動度，因此TPOAb重度升高GD患者FT4、TRAb水平明顯升高。但需要警惕該組患者存在GD合并HT的可能性，其甲狀腺功能可能在甲狀腺功能亢進(簡稱甲亢)和甲減之間頻繁波動[8]。

Th17/Treg細胞免疫失衡在自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Th17的浸潤程度與GD嚴重程度密切相關[9]。本研究對各組GD患者外周血Th17、Treg及其分泌的細胞因子IL-17、TGF-β分析發(fā)現(xiàn)，TPOAb重度升高組GD患者Th17比例、Th17/Treg比值及IL-17水平均明顯高于其余各組，且該組患者的FT4、TRAb水平明顯升高，與上述研究結論一致，表明TPOAb重度升高的GD患者甲狀腺存在嚴重的自身免疫紊亂。同時，IL-17作為重要的促炎因子，一方面可誘導多種炎性介質的表達，引起炎性細胞浸潤和甲狀腺組織損傷，另一方面IL-17還可以協(xié)同干擾素γ增強甲狀腺自身抗原的表達，激活Th細胞，刺激B細胞產生甲狀腺自身抗體，這些抗體可通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)進一步攻擊破壞甲狀腺組織細胞[10]。而TPOAb中度升高組GD患者的Th17比例、Th17/Treg比值及IL-17水平均明顯高于TPOAb陰性組和TPOAb輕度升高組，但其FT4水平明顯低于TPOAb重度升高組。這似乎與上述結論相矛盾，苑姍姍等[11]研究認為，TPOAb在單純GD、GD合并HT及HT這3種甲狀腺自身免疫疾病中所發(fā)揮的作用不同，可能與TPOAb亞型的分布及含量差異有關。Khan等[1]認為，GD患者血清中高滴度的TPOAb提示可能存在GD合并HT。綜合上述研究的結論推測，TPOAb中度升高組GD患者甲狀腺病理組織學改變與TPOAb重度升高組有差異，且兩組間TPOAb亞型及Th17細胞所發(fā)揮的作用存在差異，其機制有待進一步病理學及免疫學研究探討。

綜上，TPOAb中重度升高GD患者的Th17比例及IL-17水平明顯升高，且Th17/Treg免疫失衡較為嚴重。臨床上對于合并高水平TPOAb的GD患者，應警惕GD合并HT的可能性，TPOAb可作為重要免疫損傷監(jiān)測指標幫助臨床醫(yī)生更好地評估GD的治療及預后。