徐彩娜 石亞志 武桂平

腦缺血是一種常見的急性腦血管病，臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作的頭暈、眼花、耳鳴，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)肢體無力、意識(shí)模糊、復(fù)視甚至雙目失明[1-2]。海馬是腦內(nèi)對(duì)缺血較為敏感的部位之一，腦缺血會(huì)引起海馬缺血損傷導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙[3]。腦紅蛋白(NGB)是一種在神經(jīng)系統(tǒng)特異高表達(dá)的六配位血紅素單體球蛋白，也是一種神經(jīng)元損傷修復(fù)介質(zhì)，可促進(jìn)神經(jīng)突起生長和分支，減輕神經(jīng)元損傷[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NGB能促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷后傷區(qū)軸突再生[5]，然而其對(duì)大鼠腦缺血性神經(jīng)損傷后受損神經(jīng)元軸突生長能力的調(diào)控作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究對(duì)大鼠腦缺血性神經(jīng)損傷后NGB對(duì)受損神經(jīng)元軸突再生能力的調(diào)控作用及機(jī)制進(jìn)行探討，以期為腦缺血性神經(jīng)損傷的研究提供新思路。

材料與方法

1.材料：無特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(280±20)g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2017-0004。

2.方法

(1)分組及造模：將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Hemin組，每組10只。造模方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方法制備腦缺血模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射0.3 mg/kg 10%水合氯醛(陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司)麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，用毛剪剪短頸部正中被毛，碘伏消毒剪毛區(qū)，在其頸部做一長1.5～2.0 cm的正中切口，止血鉗鈍性分離皮下筋膜組織，暴露氣管周圍肌肉，在外科手術(shù)顯微鏡(武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司)下找到左右兩側(cè)頸總動(dòng)脈并分離結(jié)扎，消毒手術(shù)傷口周圍皮膚后縫合皮膚切口，將大鼠置于鼠籠中待其蘇醒，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1～4分視為造模成功，剔除造模失敗及死亡大鼠，并隨機(jī)補(bǔ)充。假手術(shù)組大鼠僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不穿線結(jié)扎。Hemin組大鼠于術(shù)后第1天腹腔注射50 mg/kg NGB誘導(dǎo)劑Hemin，每天1次。

(2)神經(jīng)功能評(píng)定：2周后參照Zea-longa標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定：不能自發(fā)行走且有意識(shí)障礙為4分；行走時(shí)向左側(cè)傾倒為3分；行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；不能完全伸展左側(cè)前爪為1分；無神經(jīng)功能缺損為0分。

(3)蘇木素-伊紅(HE)染色:神經(jīng)功能評(píng)定結(jié)束后處死大鼠，取其腦組織，用10%甲醛溶液(上海譜振生物科技有限公司)固定，梯度酒精(南京森貝伽生物科技有限公司)脫水，二甲苯(深圳宏正興科技有限公司)透明，石蠟包埋成塊，用組織切片機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)5μm厚連續(xù)切片，脫蠟，脫水，蘇木素(上海江萊生物科技有限公司)染色，流水沖洗，1%鹽酸溶液(上海雅吉生物科技有限公司)分化數(shù)秒，流水沖洗，伊紅(上海江萊生物科技有限公司)染色，脫水，透明，中性樹膠(上海羽朵生物科技有限公司)封片，采用顯微鏡(蘇州技高電子科技有限公司)觀察HE染色結(jié)果。

(4)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot):取各組大鼠腦組織，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入組織裂解液(北京天恩澤基因科技有限公司)，勻漿，13 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA試劑盒(上海荔達(dá)生物科技有限公司)測定蛋白濃度并進(jìn)行定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液(廣州輝駿生物科技有限公司)封閉，加入1∶1 000稀釋的兔抗生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)單克隆抗體(上海晅科生物科技有限公司)、1∶500稀釋的鼠抗神經(jīng)絲-200(NF-200)單克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)、1∶500稀釋的兔抗NGB單克隆抗體(天津卡梅德生物科技有限公司)、1∶300稀釋的兔抗磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)單克隆抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)、1∶200稀釋的兔抗磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)單克隆抗體(上海田源生物技術(shù)有限公司)、1∶500稀釋的兔抗甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜，芳香族共聚酯洗滌緩沖液(PBST)洗膜，加入1∶4 000稀釋的山羊抗小鼠IgG(杭州納晶科技有限公司)，于37 ℃孵育60 min，PBST洗膜，將膜與超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑的化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)，暗室曝光、顯影，將X光膠片用掃描儀(杭州梅清數(shù)碼科技有限公司)掃描后使用美國Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，分析各目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

結(jié) 果

1.3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較：模型組、Hemin組和假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別(3.02±0.81)分、(2.11±0.48)分和0分，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=266.158，P<0.001)。Hemin組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，且明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)正常，無核固縮現(xiàn)象，未見水腫，細(xì)胞分布比較均勻，胞體形態(tài)正常，其橫截面呈圓形，胞漿染色均勻。模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)明顯核固縮現(xiàn)象，可見明顯水腫，細(xì)胞分布散亂不均，胞體形態(tài)異常難以分辨，胞漿染色不均，尼氏小體淡染、數(shù)量減少，神經(jīng)突觸數(shù)量減少、消失，空泡細(xì)胞增多。Hemin組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)及分布趨于正常，胞漿染色較均勻，核固縮現(xiàn)象及水腫較模型組明顯減少，尼氏小體深染、數(shù)量增多，神經(jīng)突觸數(shù)量增多，空泡細(xì)胞減少。見圖1。

注：A:假手術(shù)組；B：模型組；C：Hemin組;白色箭頭表示正常的錐體細(xì)胞，黑色箭頭表示固縮的錐體細(xì)胞圖1 3組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，×400)

3.3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達(dá)量比較：模型組、Hemin組大鼠腦組織中NGB蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，且Hemin組明顯高于模型組(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達(dá)

表1 3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達(dá)量比較

4.3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)量比較：模型組、Hemin組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，且Hemin組明顯高于模型組(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)量比較

圖3 3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)

5.3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白變化：模型組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，Hemin組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)，Hemin組明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白變化

表3 3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白變化

討 論

目前，關(guān)于腦缺血對(duì)海馬神經(jīng)元影響的研究很多。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可導(dǎo)致海馬形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能改變[6]。有研究結(jié)果顯示，大鼠腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分升高，腦梗死面積增加[7]。Che等[8]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠在腦缺血15 min后可見海馬CA1區(qū)的θ節(jié)律的振幅下降，且該區(qū)域錐體細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞骨架遭到破壞，神經(jīng)突觸密度降低，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，出現(xiàn)明顯水腫及核固縮現(xiàn)象。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，提示大鼠腦缺血后易造成神經(jīng)元損傷[7-8]。此外有文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血還可引起海馬內(nèi)細(xì)胞因子改變，如NF-200、GAP-43等[9]。GAP-43是一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白，由神經(jīng)元胞體合成，在損傷后神經(jīng)元胞體和出芽再生神經(jīng)軸突中高度表達(dá)，參與快速軸索運(yùn)輸、神經(jīng)軸突生長及修復(fù)[10]。NF-200是一種構(gòu)成神經(jīng)胞體及軸突骨骼框架的結(jié)構(gòu)蛋白，在維持神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及軸突運(yùn)輸中具有重要作用，能較好地反映神經(jīng)軸突損傷和修復(fù)情況，間接提示軸突再生狀況[11]。腦缺血損傷發(fā)生后，NF-200在缺血損傷周邊區(qū)神經(jīng)軸突合成增加，以適應(yīng)神經(jīng)再生的需要[12]。因此，本研究將NF-200、GAP-43蛋白作為神經(jīng)元軸突再生的標(biāo)志性蛋白，結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，說明腦缺血神經(jīng)損傷后存在神經(jīng)元軸突再生。

NGB是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)分子，是血紅素蛋白(HP)家族新成員，主要表達(dá)于代謝、耗氧劇烈的脊椎動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞中，在腦缺血缺氧、毒物損傷、氧化應(yīng)激(OS)等病理情況下，NGB的表達(dá)均有不同程度的增加，其與氧具有高度親和力，可通過協(xié)助氧轉(zhuǎn)運(yùn)、清除自由基、與細(xì)胞色素C(CYC)相互作用等多種途徑增強(qiáng)組織對(duì)缺血性損傷的耐受，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用[13]。Hemin即氯化高鐵血紅素，可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞NGB高表達(dá)，為NGB的誘導(dǎo)劑[14]。Tao等[15]通過體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，NGB誘導(dǎo)劑Hemin濃度升高可減少神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，給予NGB誘導(dǎo)劑Hemin干預(yù)后，Hemin組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞病理損傷程度較模型組明顯下降，大鼠腦組織中NGB、NF-200、GAP-43蛋白表達(dá)量較模型組明顯升高，說明NGB能夠促進(jìn)大鼠腦缺血性神經(jīng)損傷后神經(jīng)元大量合成NF-200、GAP-43，從而加速神經(jīng)元軸突再生，促進(jìn)神經(jīng)組織損傷的修復(fù)。但目前NGB作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子改善神經(jīng)功能的機(jī)制尚不清楚，有研究認(rèn)為，大鼠腦缺血性損傷后NGB對(duì)受損神經(jīng)元軸突再生的改善作用與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[16]，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，Hemin組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，其原因可能是PI3K導(dǎo)致了下游直接靶蛋白AKT的磷酸化，P-AKT進(jìn)一步誘導(dǎo)下游效應(yīng)分子的激活，導(dǎo)致細(xì)胞存活信號(hào)通路PI3K/AKT的激活，從而促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞再生。因此，本研究從分子水平進(jìn)一步表明了PI3K/Akt信號(hào)通路可能介導(dǎo)了NGB對(duì)腦缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，NGB可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)大鼠腦缺血性神經(jīng)損傷后神經(jīng)元生長相關(guān)蛋白NF-200、GAP-43表達(dá)，以促進(jìn)受損神經(jīng)元軸突再生，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血性神經(jīng)損傷的改善作用。