高艷 刁宗禮 張啟東 劉文虎

至2030年，全球尿毒癥患者人數(shù)預(yù)計將高達(dá)544萬，其中亞洲地區(qū)增長速度最快，尤其是中國[1]。對此，除了努力提高人們對慢性腎臟病的早發(fā)現(xiàn)和早治療意識，還須建立一個模擬慢性腎功能衰竭(CRF)早期階段的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從而能夠評估減緩或阻止疾病進(jìn)展的治療策略。CRF常伴隨鈣磷代謝紊亂，血管鈣化是CRF患者心血管死亡的主要危險因素之一[2]。因此，選擇恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ瓦M(jìn)行鈣磷代謝研究具有重要意義。由于文獻(xiàn)中較少涉及CRF大鼠糞及尿液的鈣磷排泄，本研究進(jìn)行初步探討，以期為建立CRF的模型及研究鈣磷代謝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及參考。

材料與方法

1.材料：健康無特定病原體的雄性SD大鼠(SPF級)80只，體質(zhì)量(224.31±6.26) g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部供給。飼料由北京華阜康生物科技有限公司供給。腺嘌呤(Adenine)分子量135.13由美國Sigma公司供給。

2.方法:將雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對照組(22只)和CRF組(58只)。CRF組大鼠給予0.75%腺嘌呤飼料喂食，自由飲水。正常對照組大鼠自由攝取普通飼料、飲水。實(shí)驗(yàn)周期為6 周。每天觀察所有大鼠飲食、精神、反應(yīng)、活動、毛發(fā)及尿量等情況。6 周后測量大鼠體質(zhì)量,用代謝籠收集其24 h尿液及糞便,取眼眶靜脈血約1 ml，以4 000 r/min離心10 min,分離血清檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、鈣、磷及尿鈣和磷、糞鈣水平。斷頭處死大鼠并迅速取部分腎臟組織,用10%福馬林液固定,石蠟包埋后切片、染色，行光鏡病理組織學(xué)檢查并攝片。以肉眼和顯微鏡觀察腎臟組織的大體及病理變化。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動物保護(hù)研究小組委員會(批準(zhǔn)號16-1012)審核批準(zhǔn)，并按照國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動物保護(hù)和使用指南進(jìn)行。

結(jié) 果

1.大鼠一般狀態(tài):正常對照組大鼠飲食如常,反應(yīng)靈敏,體毛順滑有光澤,二便正常。CRF組大鼠隨著喂食腺嘌呤天數(shù)增加,與正常對照組比較逐漸出現(xiàn)攝食量減少，到第5周后飲水量和尿量明顯增加,消瘦明顯,體毛逐漸干枯萎黃脫落稀疏，松散無光澤，同時體重下降，并出現(xiàn)精神萎靡,活動力下降,行動無力，弓背、蜷縮等。

2.大鼠死亡情況:正常對照組大鼠飼養(yǎng)中未出現(xiàn)死亡，CRF組大鼠死亡20只，總死亡率高達(dá)34.48%。

3.兩組大鼠血生化功能比較:CRF組大鼠血BUN、SCr水平均高于正常對照組，體重及血鈣水平均低于正常對照組(P<0.05),而兩組血磷水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠血生化功能比較

4.兩組大鼠24 h尿磷和鈣、糞鈣代謝水平比較:與正常對照組比較，CRF組大鼠24 h尿量明顯增多，波動在15～45 ml，平均尿量(30.45±8.60) ml，對照組大鼠尿量一般在8～10 ml，平均尿量(10.21±2.35) ml。CRF組大鼠24 h尿鈣及尿磷代謝水平明顯高于正常對照組，校正體質(zhì)量后的24 h尿磷和鈣、糞鈣代謝水平仍均高于正常對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組大鼠24 h尿鈣、磷及糞鈣代謝水平比較

5.兩組大鼠腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果:肉眼下可見正常對照組大鼠腎臟呈紅褐色，表面圓潤光滑，質(zhì)軟，皮髓質(zhì)分界清楚。CRF組大鼠腎臟較正常對照組明顯增大，呈灰白色，質(zhì)地較硬，表面凹凸不平，可見彌漫的小米粒大小的白色顆粒，腎皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界不清，呈“大白腎”，觸之易碎，重量較對照組重3～6倍,見圖1。光鏡下可見正常對照組大鼠腎臟組織腎小球數(shù)量及結(jié)構(gòu)無明顯異常，未見纖維化等病變，腎小管排列整齊，上皮完好，未見變性、壞死及管型，腎間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化；CRF組大鼠腎臟組織腎小球數(shù)量明顯減少,殘存腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管呈囊性擴(kuò)張，腎小管內(nèi)可見許多棕褐色針狀結(jié)晶沉積，腎臟局灶間質(zhì)纖維化，伴大量淋巴和單核細(xì)胞浸潤，腎臟血管數(shù)量明顯減少，腎小球囊腔擴(kuò)大，遠(yuǎn)曲小管和集合管擴(kuò)張,腔內(nèi)有炎性細(xì)胞的浸潤,成纖維細(xì)胞明顯增多。見圖2、3。

討 論

理想的動物模型應(yīng)具備良好的臨床相似性,相似度越高,越有利于人類疾病的研究。目前使用的CRF模型很多，從造模機(jī)制上分為以下幾種：(1)物理學(xué)方法，其中腎大部切除法以減少或破壞腎臟組織應(yīng)用較多；(2)化學(xué)方法，利用腎毒性藥物破壞腎臟組織，如腺嘌呤誘導(dǎo)CRF模型是腎病科研領(lǐng)域應(yīng)用較多的經(jīng)典方法之一[3]。腺嘌呤誘導(dǎo)造模型方法包括灌胃法和混入飼料喂養(yǎng)法。腺嘌呤劑量的大小和喂養(yǎng)時間的長短可誘發(fā)輕、中、重度不同腎功能衰竭模型。有關(guān)文獻(xiàn)報道腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃第4周時大鼠腎功能出現(xiàn)異常；第8周時出現(xiàn)與人類CRF相類似的貧血、高血壓、脂代謝及鈣磷代謝紊亂；第12周時腎功能嚴(yán)重受損,并發(fā)癥突出；停止腺嘌呤灌胃并繼續(xù)飼養(yǎng),腎功能繼續(xù)下降,提示腎臟病變已進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的慢性進(jìn)展過程，若以腺嘌呤300 mg·kg-1·d-1灌胃3周時大鼠死亡率高達(dá)42.86%[4]。以0.75%腺嘌呤300 mg·kg-1·d-1飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，大鼠血SCr、BUN水平明顯升高，若此時停藥，間隔1個月再采血，SCr及BUN水平明顯下降,說明喂養(yǎng)腺嘌呤飼料4周對制造穩(wěn)定的大鼠CRF模型是不夠的[5]。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)腺嘌呤飼養(yǎng)4周后投喂大鼠正常飼料，間隔2周其體重增加，毛發(fā)光澤度增加，活動度好，SCr及BUN上升，故本實(shí)驗(yàn)CRF造模周期設(shè)為6周。隨著喂食腺嘌呤時間的增加，大鼠日漸消瘦,畏寒肢冷、蜷縮弓背、精神萎靡、體毛脫落、活動減少，尿量明顯增多,BUN、SCr水平升高。第5周時大鼠開始逐漸出現(xiàn)死亡，最終死亡率高達(dá)34.48%,分析原因可能為造模藥物相關(guān)死亡。造模6周時檢測大鼠SCr基本波動在200～350 μmol/L，這些均提示腺嘌呤造模成功。

CRF大鼠模型腎臟體積增大，重量增加，呈“大白腎”，符合既往學(xué)者報道該模型腎臟體積變化與實(shí)際臨床CRF腎體積縮小存在差異。光鏡下腎臟組織中大量的黃褐色二羥基腺嘌呤結(jié)晶沉積,部分腎小管完全破壞并有炎性細(xì)胞浸潤,局部纖維組織增生。說明利用0.75%腺嘌呤飼養(yǎng)大鼠,可成功制備CRF模型。有關(guān)研究報道口服腺嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用被迅速代謝成極難溶于水的2，8-二羥基腺嘌呤，沉積在近端管狀上皮根尖區(qū)形成晶體，影響氮質(zhì)化合物的排泄，從而影響組織內(nèi)細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致血BUN和SCr水平升高，最終導(dǎo)致腎功能不全[6-7]。也有文獻(xiàn)報道電鏡下可見腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)有結(jié)晶沉積和大量膠原纖維,提示腎小管上皮細(xì)胞可吸收結(jié)晶，并可能發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[8]，其機(jī)制是利用腎毒性藥物導(dǎo)致腎臟損害的原理，同時這種誘導(dǎo)CRF的方法避免了手術(shù)(如腎臟切除術(shù)和電灼術(shù))誘導(dǎo)CRF的潛在并發(fā)癥，為研究CRF的較好模型。腺嘌呤混合飼料喂養(yǎng)，操作簡便，節(jié)省了人力和花費(fèi)，腎臟衰竭現(xiàn)象明顯，有重要的科研價值。

鈣穩(wěn)態(tài)對于確保生理內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，因此，血鈣水平必須在很窄的范圍內(nèi)波動以精確調(diào)節(jié)游離細(xì)胞外鈣的水平[9]。血管鈣化是CRF患者心血管死亡和全因死亡的主要危險因素，發(fā)病機(jī)制尚不清楚[2]。本研究中CRF組大鼠給予0.75%腺嘌呤飼養(yǎng)6周后出現(xiàn)鈣磷代謝紊亂，血鈣較正常對照組下降，血磷較正常對照組增高。分析其原因?yàn)橄汆堰蕦δI小管破壞，腎臟局灶間質(zhì)纖維化，使得腎小管對鈣磷重吸收功能下降，表現(xiàn)為多尿、尿鈣增加及血鈣下降。慢性腎臟病是一種功能性維生素D缺乏的狀態(tài)，后者缺乏導(dǎo)致胃腸道鈣吸收減少[10]，進(jìn)一步導(dǎo)致糞鈣增加,血鈣降低?；加邢鄬^嚴(yán)重疾病的兒童，包括幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年皮肌炎和嚴(yán)重厭食神經(jīng)癥[11]，鈣吸收能力均低于年齡、性別和青春期狀況相匹配的健康兒童組。有關(guān)文獻(xiàn)報道正常鈣攝入時，慢性腎臟病患者胃腸道鈣吸收能力低于正常對照組，進(jìn)入血液透析階段的患者鈣吸收能力較正常人群低[12],進(jìn)一步支持了推論。

CRF組與正常對照組大鼠24 h糞鈣無明顯差異。因CRF組大鼠體重明顯低于對照組，故進(jìn)行體重校正后比較發(fā)現(xiàn)，CRF組大鼠造模后24 h糞鈣水平較正常對照組明顯升高。同時通過體重校正，可以比較不同物種、同物種不同年齡階段(如老人、兒童)鈣的排泄，從而對鈣的流失及補(bǔ)充起一定指導(dǎo)意義。多種因素可能影響鈣的攝入量和吸收率，從而影響糞鈣水平。幼犬低磷飲食后血磷下降，血清鈣濃度呈相反的變化趨勢[13]，提示磷的變化會影響體內(nèi)鈣代謝變化。小腸對鈣吸收的同時通過上皮細(xì)胞的脫落和消化腺分泌將體內(nèi)的鈣從腸道排到體外，這些被腸道排出的鈣即為內(nèi)源性糞鈣(EFC)，狗的EFC水平為15～20 mg/kg，為成人(1.5～2.0 mg/kg)的10倍。有關(guān)報告早產(chǎn)兒的EFC更高(17～86 mg·kg-1·d-1)。狗的EFC與尿鈣比為20 ∶1，而在人類中通常約為1∶1[14]。在體內(nèi)鈣丟失上，EFC無論從數(shù)量還是重要性上都比尿鈣重要，EFC的探討也許對于體內(nèi)鈣的代謝及鈣化的深入研究有一定參考價值。CRF組大鼠SCr較正常對照組明顯增加，且出現(xiàn)鈣磷代謝紊亂，腎臟病理變化也較明顯。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于雖然實(shí)驗(yàn)中已留取24 h尿量，但未檢測尿肌酐及進(jìn)一步計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)以反映腎臟病變嚴(yán)重程度，因此無法類比人類的腎功能分期。

對于透析前血鈣水平正常的患者,若使用鈣離子濃度超過1.5 mmol/L的透析液,則有20.0%～83.3%的患者會發(fā)生高鈣血癥,從而加重了轉(zhuǎn)移性鈣化的發(fā)生[15]。若鈣負(fù)荷增加,對于少尿或無尿的透析患者，除了血管軟組織鈣質(zhì)沉積外，EFC是否排泄增加，磷攝入量、鈣攝入量和吸收分?jǐn)?shù)之間的相互作用對EFC的影響程度值得進(jìn)一步探討。