郭玉梅 張琳 李海洲

P2Y12受體拮抗劑是目前臨床上常見的抗血小板藥物[1]，尤其以氯吡格雷的應(yīng)用最廣泛。氯吡格雷本身屬于無活性的前體物質(zhì)，需要經(jīng)肝藥酶代謝才能生成有抗血小板活性的硫醇代謝產(chǎn)物，通過與血小板P2Y12受體細(xì)胞外半胱氨酸相互作用，不可逆地阻斷血小板表面二磷酸腺苷(ADP)與P2Y12受體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抗血小板激活的作用[2]。阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷一直是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后雙聯(lián)抗血小板治療的標(biāo)準(zhǔn)方案[3]，在臨床上，雖然部分患者遵醫(yī)囑服用標(biāo)準(zhǔn)劑量氯吡格雷，但仍有4%～30%的患者發(fā)生氯吡格雷抵抗[4]，包括支架內(nèi)血栓、再發(fā)急性心肌梗死、猝死等缺血事件。目前有研究證實(shí)，除了患者依從性和氯吡格雷代謝相關(guān)基因多態(tài)性因素外，血小板內(nèi)特異性表達(dá)的微小RNA(miRNA，miR)也可能在血小板活化過程中發(fā)揮重要作用[6]。Landry等[7]發(fā)現(xiàn)miR-223通過調(diào)節(jié)P2Y12受體的表達(dá)降低血小板抑制率，而血小板抑制率降低后，又可反饋性抑制miR-223的分泌。有研究結(jié)果顯示，miR-21可能與血小板聚集、血管內(nèi)皮功能及氯吡格雷代謝有關(guān)[8]。因此，本研究主要探討血小板miR-223和miR-21作為冠心病患者行PCI后抗血小板反應(yīng)性生物標(biāo)志物的可能性，旨在為篩選氯吡格雷抵抗的高?；颊咛峁┹o助參考指標(biāo)，以盡快調(diào)整用藥方案，盡量實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2017年1月～2018年8月于我院行PCI的冠心病患者119例，其中男74例，女45例，年齡35～84歲，平均年齡(66.03±9.89)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并本研究用藥禁忌證；(2)PCI前行溶栓治療；(3)既往曾接受過PCI；(4)血小板計(jì)數(shù)<125×109/L或>350×109/L；(5)PCI前1個(gè)月服用抗凝藥物或其他抗血小板藥物；(6)合并心肌病、惡性腫瘤、急慢性感染或活動(dòng)性出血。根據(jù)血小板抑制率，將患者分為氯吡格雷反應(yīng)正常組(正常組)67例(56.3%)和氯吡格雷抵抗組(抵抗組)52例(43.7%)。本研究經(jīng)我院倫理委員審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)治療方案：所有患者PCI前均口服負(fù)荷劑量氯吡格雷300 mg+阿司匹林腸溶片300 mg。術(shù)后繼續(xù)遵醫(yī)囑口服阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg每天1次及他汀類藥物等維持治療。

(2)血小板抑制率檢測(cè)：所有患者均于PCI后服用氯吡格雷48 h后采集空腹靜脈血2 ml，置于枸櫞酸鈉真空采血管中，于2 h內(nèi)采用TEG5000血栓彈力圖凝血分析儀(美國(guó)Haemoscope公司)檢測(cè)以花生四烯酸(AA)和ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率，根據(jù)使用說明，若血小板抑制率<50%則定義為氯吡格雷抵抗；否則為氯吡格雷反應(yīng)正常，其中氯吡格雷反應(yīng)正常又分為氯吡格雷敏感(75%≤血小板抑制率≤100%，敏感組)和有效(50%≤血小板抑制率<75%，有效組)，氯吡格雷抵抗又分為氯吡格雷低反應(yīng)(20%≤血小板抑制率<50%，低反應(yīng)組)和無效(血小板抑制率<20%，無效組)[9]。

(3)血小板miR-223和miR-21水平檢測(cè)：采集所有患者PCI后次日清晨空腹肘靜脈血5 ml，1 500 r/min離心5 min，取血小板富集層，加入40 ml人CD45磁珠beads試劑重懸，采用磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)收集血小板，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板純度。采用Trizol法(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)提取血小板總RNA，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(大連TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，加入miR-223和miR-21莖環(huán)引物(上海生工公司提供)和SYBR Green熒光染料(試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa公司)進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s預(yù)變性，45個(gè)循環(huán)(95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸45 s)。引物序列：miR-223(F：5’-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3’；R：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3’)；miR-21(F：5’-GTGTGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3’；R：5’- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3’)；U6(F：5’-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3’；R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)。收集熒光信號(hào)，以小分子U6作為內(nèi)參。所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行樣本和無模板的陰性對(duì)照，以2-ΔΔCt表示目的miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

結(jié)果

1.兩組患者臨床資料比較:抵抗組患者WBC計(jì)數(shù)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血小板miR-223、miR-21水平高于正常組，Hb低于正常組(P<0.05),兩組其余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的影響因素分析:以發(fā)生氯吡格雷抵抗作為因變量(氯吡格雷抵抗賦值1，氯吡格雷反應(yīng)正常賦值0)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量，行多元logistic回歸分析結(jié)果顯示，血小板miR-223和miR-21水平升高是冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，而WBC計(jì)數(shù)、Hb、HDL-C不是其發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立影響因素(P>0.05)。見表2。

表2 冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的影響因素分析

3.各亞組患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比較:各亞組患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著血小板抑制率降低，血小板miR-223和miR-21表達(dá)水平均逐漸升高，其中無效組患者最高，而敏感組患者最低(P<0.05)。見表3。

表3 各亞組患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比較

4.行PCI的冠心病患者血小板miR-223、miR-21水平與血小板抑制率的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，行PCI的冠心病患者血小板miR-223和miR-21水平與血小板抑制率均呈負(fù)相關(guān)(分別為r=-0.384，P<0.001；r=-0.506，P<0.001)。

5.血小板miR-223和miR-21對(duì)冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的預(yù)測(cè)價(jià)值:血小板miR-223預(yù)測(cè)冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的ROC曲線下面積(AUC)為0.69(95%CI0.53～0.78)；血小板miR-21的AUC為0.64(95%CI0.51～0.69)；血小板miR-223聯(lián)合miR-21的AUC為0.85(95%CI0.77～0.94)。血小板miR-223聯(lián)合miR-21的預(yù)測(cè)價(jià)值高于血小板miR-223或miR-21單獨(dú)的預(yù)測(cè)價(jià)值。見圖1。

討 論

血栓形成是導(dǎo)致冠心病并發(fā)癥的重要病理因素之一，因此，抗血小板治療是冠心病治療尤其是預(yù)防PCI后血栓形成的重要基石。阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療是我國(guó)目前各指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案，但由于冠心病病因復(fù)雜及患者個(gè)體化差異等因素影響，常無法兼顧療效和出血風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)現(xiàn)抗血栓治療的最大獲益除需要不斷完善介入技術(shù)和醫(yī)療器械及輔以專業(yè)護(hù)理外，提前篩選發(fā)生氯吡格雷抵抗的高危患者，選擇合理的個(gè)體化治療方案，也是改善其預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

氯吡格雷屬于二代噻吩砒啶類衍生物，通過不可逆地阻斷ADP受體，抑制纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抑制血小板聚集作用[10]。個(gè)體差異性是氯吡格雷發(fā)揮抗血小板作用過程中不可忽視的難點(diǎn)。Cori等[11]研究顯示，約4%～30%的冠心病患者接受規(guī)范治療后會(huì)發(fā)生氯吡格雷抵抗，大大增加臨床血栓事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，119例冠心病患者行PCI后遵醫(yī)囑服用阿司匹林和氯吡格雷，其中52例患者血小板抑制率<50%，氯吡格雷抵抗的發(fā)生率為43.7%。近年來，考慮到比濁法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性不高，我院逐漸采用床旁血栓彈力圖檢測(cè)儀代替比濁法用于血小板反應(yīng)性檢測(cè)。

除代謝相關(guān)基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的發(fā)生相關(guān)外，循環(huán)miRNA亦可能與其相關(guān)，因此，有學(xué)者開始從循環(huán)miRNA角度尋找方便檢測(cè)且有效預(yù)測(cè)發(fā)生氯吡格雷抵抗的生物標(biāo)志物[12]，作為輔助預(yù)測(cè)因子，用于高?；颊叩暮Y選，以指導(dǎo)臨床用藥。雖然miRNA的表達(dá)譜和功能尚不明確，但因其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞、組織、疾病表達(dá)特異性，其作為疾病標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)逐漸得到認(rèn)可。人類血小板中存在大量穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，在血小板mRNA轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[13]。如Kaudewitz等[14]發(fā)現(xiàn)血小板miR-223、miR-21可調(diào)節(jié)P2Y12受體mRNA表達(dá)，且與血小板反應(yīng)性密切相關(guān)。孫埡娉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223是外周血中血小板、微泡、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞中表達(dá)量最高的miRNA。很多研究證實(shí)miR-223不僅影響血小板生成，而且影響血小板功能，包括血小板表面抗原表達(dá)、粘附、聚集、活化等。miR-21同樣在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Massimi等[16]的研究結(jié)果顯示，miR-21通過Tropomyosin I介導(dǎo)血小板衍生因子-BB的分泌和功能，從而影響心肌缺血。且Barwari等[17]的研究結(jié)果顯示，miR-21可影響血小板的數(shù)量、大小及功能。本研究中，抵抗組患者血小板miR-223、miR-21水平高于正常組，且隨著血小板抑制率降低，血小板miR-223和miR-21表達(dá)水平均逐漸升高，其中氯吡格雷無效組最高，而氯吡格雷敏感組最低；多元logistic回歸分析結(jié)果顯示，血小板miR-223和miR-21水平升高是冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，行PCI的冠心病患者血小板miR-223和miR-21水平與血小板抑制率均呈負(fù)相關(guān)，表明血小板miR-223、miR-21與血小板的功能密切相關(guān)。在本研究中，ROC曲線分析結(jié)果顯示，血小板miR-223和miR-21單獨(dú)或聯(lián)合預(yù)測(cè)冠心病患者PCI后發(fā)生氯吡格雷抵抗的AUC均較高，且二者聯(lián)合的預(yù)測(cè)價(jià)值高于二者單獨(dú)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，冠心病患者PCI后服用雙聯(lián)抗血小板治療存在較大的個(gè)體差異性，其血小板miR-223和miR-21水平與血小板反應(yīng)性呈明顯負(fù)相關(guān)，抗血小板治療前聯(lián)合檢測(cè)血小板miR-223和miR-21水平有助于篩選氯吡格雷抵抗的高?；颊?，在個(gè)體化抗血小板治療方面具有一定的參考價(jià)值。