倫曉名，沈育娟，邢倩，徐曉娜，翟紅立

(青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院a.免疫風濕科，b.中心實驗室，山東 青島 266071)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的慢性、進行性自身免疫性疾病。其基本病理改變?yōu)榛ぱ?，可侵襲關(guān)節(jié)軟骨、骨、關(guān)節(jié)囊，最終導致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。在RA患者中，骨量減少及骨質(zhì)疏松的發(fā)生率遠高于正常人[2]，且RA繼發(fā)骨質(zhì)疏松致骨脆性骨折的發(fā)生率增加，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3]。因此，早期、及時的治療至關(guān)重要。人體內(nèi)骨代謝平衡是由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成調(diào)控，此過程由許多細胞因子和信號通路調(diào)控[4]，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子(receptor activator of thenuclear factor-κB，RANK)是主要的骨重建調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)機體骨代謝活動，血清1型膠原C端肽(C-terminal telopeptide of type 1 collagen，CTX-1)、血清骨1型前膠原N端延長肽(procollagen type 1 N-terminal propeptide，P1NP)是最常用的兩種骨重建標志物，可反映機體骨代謝狀態(tài)[5]。輔助性T細胞17(helper T cell 17，Th17細胞)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)均由CD4+T淋巴細胞分化而來，它們可通過調(diào)控多種細胞因子影響成骨細胞與破骨細胞的激活與分化，并與骨代謝密切相關(guān)[6]。而艾拉莫德為治療RA的新型慢作用抗風濕藥物，其不僅可以調(diào)節(jié)免疫反應，抑制各種炎癥細胞因子的產(chǎn)生，改善患者臨床癥狀，還有一定的骨保護作用。本研究旨在探討艾拉莫德對RA合并骨量低下患者骨代謝指標及外周血中Th17、Treg細胞的影響，為RA的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年7月至2019年2月于青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院東院區(qū)免疫風濕科門診及住院治療的60例RA合并骨量低下患者為研究對象，按照隨機數(shù)字法分為對照組和觀察組，每組30例。其中，對照組男4例、女26例，年齡45～70歲，平均(58±8)歲；病程45～90個月，平均(68±21)個月。觀察組男3例、女27例，年齡44～69歲，平均(57±9)歲；病程44～89個月，平均(67±21)個月。兩組患者的性別、年齡、病程比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：①所有患者均符合2010年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯(lián)盟制訂的RA診斷標準[7]，且類風濕關(guān)節(jié)炎活動度評分-28(disease activity score for rheumatoid arthritis-28，DAS-28)>3.2，即為中重度活動；②符合2019年中國老年骨質(zhì)疏松癥診療指南[8]雙能X線吸收法中骨量低下的診斷標準，測得T值(腰椎1～4、股骨頸或全髖)<-1.0 SD[包括骨量減少(-2.5 SD

1.3治療方法 對照組給予甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，批號：170803，每片2.5 mg)治療，每次10 mg，每周1次；觀察組在對照組的基礎(chǔ)上加用艾拉莫德(湖南先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：42-170301，每片25 mg)，每次25 mg，每日2次。兩組均治療3個月。所有患者均在服用甲氨蝶呤片后的第2天服用葉酸片，每次10 mg，以減少甲氨蝶呤引起的不良反應。

1.4觀察指標及檢測方法

1.4.1血清學指標 所有患者分別于治療前及治療后3個月抽取空腹靜脈血5 mL，檢測骨代謝指標{CTX-1、P1NP、RANKL、OPG、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、25-羥維生素D3[25-hydroxy vitamin D3，25(OH)D3]}和血清炎癥細胞因子[IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β、TGF-α]水平。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血RANKL、OPG、IL-10、IL-17、TGF-β、TGF-α水平；經(jīng)電化學發(fā)光免疫法檢測血CTX-1、P1NP、PTH、25(OH)D3水平。

1.4.2臨床指標 測定關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count，TJC)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count，SJC)(TJC、SJC分別由2名專科醫(yī)師獨立評估)，并根據(jù)TJC、SJC及紅細胞沉降率數(shù)值計算DAS28。

1.4.3Th17、Treg細胞流式檢測 將抽取的空腹靜脈血常規(guī)分離外周血單個核細胞，采用流式細胞儀(美國Beckman公司生產(chǎn)，型號：ASTRIOS EQ)分別檢測抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人CD25-PE單克隆抗體、抗人叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3-PE-Cy5單克隆抗體標記的Treg細胞及抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人IL-17-PE單克隆抗體標記的Th17細胞。以上抗體均購自美國eBioscience公司。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者治療前后骨代謝指標的變化 治療前后CTX-1、P1NP、RANKL、OPG、PTH、25(OH)D3的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，兩組間CTX-1、RANKL、OPG的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，P1NP、PTH、25(OH)D3的主效應差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；P1NP、PTH的時點間與組間不存在交互作用(P>0.05)，CTX-1、RANKL、OPG、25(OH)D3的時點間與組間存在交互作用(P<0.05)，對照組與觀察組治療前后CTX-1、RANKL、OPG、25(OH)D3的變化幅度不同。見表1。

表1 兩組RA合并骨量低下患者治療前后骨代謝指標的變化

2.2兩組患者治療前后臨床指標、血清炎癥細胞因子水平的變化 治療前后DAS-28、IL-10、IL-17、TGF-β、TGF-α的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，兩組間DAS-28、IL-17、TGF-α的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-10、TGF-β的主效應差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IL-10的時點間與組間不存在交互作用(P>0.05)，DAS-28、IL-17、TGF-β、TGF-α的時點間與組間存在交互作用(P<0.05)，對照組與觀察組治療前后DAS-28、IL-17、TGF-β、TGF-α的變化幅度不同。見表2。

2.3兩組患者治療前后Th17、Treg細胞表達水平的變化 治療前后Th17、Treg細胞表達水平的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，兩組間Th17、Treg細胞表達水平的主效應差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Th17、Treg細胞表達水平的時點間與組間存在交互作用(P<0.05)，對照組與觀察組治療前后Th17、Treg細胞表達水平的變化幅度不同。見表3。

3 討 論

在我國，RA是一種致殘率較高的疾病，疾病本身和治療時激素的使用等使患者容易合并骨量低下。對于RA繼發(fā)骨量減少者，應進行早期識別和有效治療。目前，慢作用抗風濕藥物是治療RA的一線用藥，其中甲氨蝶呤作為錨定藥物被廣泛應用。由于RA發(fā)病機制的復雜性和疾病表現(xiàn)的異質(zhì)性，部分患者對甲氨蝶呤單藥連續(xù)治療不應答或應答不佳，所以臨床對RA的治療多采用甲氨蝶呤聯(lián)合其他慢作用抗風濕藥物，以增加療效提高治療的順應性[9]。而艾拉莫德作為新型慢作用抗風濕藥物在臨床已廣泛應用，Wang等[10]研究表明，艾拉莫德聯(lián)合甲氨蝶呤較單用甲氨蝶呤能更有效地抑制炎癥、降低疾病活動度及改善病情，同時艾拉莫德還可以通過調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號通路參與骨代謝，防止骨破壞。

人體骨骼內(nèi)成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨破壞處于動態(tài)平衡，從而使機體保持正常的骨代謝，一旦這種平衡被打破就會出現(xiàn)骨量減少，甚至發(fā)生骨質(zhì)疏松[11]。RANKL/RANK/OPG信號通路在骨代謝的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。RANKL是腫瘤壞死因子中的一員，其與破骨細胞表面的RANK受體結(jié)合后促進破骨細胞的激活和分化[12]。OPG作為RANKL的誘餌受體，可通過切斷RANKL與RANK之間的聯(lián)系以防止骨吸收[5,13]。RA患者血清中RANKL/OPG的比值升高[14]。但在RA患者體內(nèi)，RANKL的高表達和OPG的低表達促進了RANKL介導的骨量流失。CTX-1是骨破壞十分敏感且特異的一個標志物[15]。P1NP是骨形成的標志物。CTX-1和P1NP水平反映了骨吸收和骨形成的激活狀態(tài)，并容易受到RANKL/RANK/OPG信號通路的調(diào)節(jié)[5]。同時，25(OH)D3、PTH也是反映骨代謝的重要標志物。因此，可以通過CTX-1、P1NP、25(OH)D3、PTH了解機體的骨代謝狀況。已有研究表明，RA患者的骨代謝失衡主要由破骨細胞所驅(qū)動，而艾拉莫德可通過抑制骨破壞發(fā)揮骨保護作用[16]。本研究結(jié)果顯示，治療后兩組患者的CTX-1、RANKL水平降低，OPG水平升高，但兩組各指標的變化幅度不同(P<0.05)，提示艾拉莫德可能通過作用于RANKL/RANK/OPG信號通路抑制骨破壞，從而發(fā)揮骨保護作用。

表2 兩組RA合并骨量低下患者治療前后臨床指標、血清炎癥細胞因子水平的變化

表3 兩組RA合并骨量低下患者治療前后Th17、Treg細胞表達水平的變化

Th17、Treg細胞在正常免疫狀態(tài)下保持平衡狀態(tài)，其中Th17細胞表現(xiàn)出高度的促炎作用，并對破骨細胞和骨破壞有促進作用[17]。而抑制Treg細胞的表達可加重關(guān)節(jié)炎癥狀，促進Treg細胞的表達可減輕炎癥反應和骨損傷程度[18]。RA患者體內(nèi)Th17/Treg細胞失衡，即Th17細胞表達增加而Treg細胞表達減少，艾拉莫德可下調(diào)Th17細胞并上調(diào)Treg細胞，從而改善RA患者癥狀[19]。Th17細胞主要通過產(chǎn)生IL-17和腫瘤壞死因子-α等細胞因子發(fā)揮作用，其中IL-17不僅可以直接促進RANKL的表達，還可作為前炎癥介質(zhì)，在炎癥的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，而Treg細胞可直接作用于成骨細胞促進OPG的表達[20]。本研究結(jié)果顯示，兩組患者的DAS28評分、IL-17水平降低，Treg細胞表達水平升高，但兩組各指標變化幅度不同(P<0.05)，提示艾拉莫德具有抗炎作用，其可能通過下調(diào)IL-17抑制機體的炎癥反應發(fā)揮骨保護作用。

綜上可知，甲氨蝶呤聯(lián)合艾拉莫德治療較甲氨蝶呤單藥能更好地改善活動性RA合并骨量低下患者的疾病活動度，艾拉莫德通過上調(diào)OPG、下調(diào)RANK抑制骨質(zhì)破壞發(fā)揮骨保護作用，通過下調(diào)炎癥細胞因子調(diào)節(jié)Th17、Treg細胞平衡發(fā)揮抗炎作用。但本研究由于治療時間較短和樣本量較少可能存在結(jié)果偏倚，需要進一步研究。