張珊珊，祁曉莉，秦云，張立英，盧曉紅，王彥

(北京市大興區(qū)人民醫(yī)院病理科，北京 102600)

乳腺葉狀腫瘤(phyllodes tumor of breast，PTB)是發(fā)生在女性的一種罕見病，發(fā)生率占乳腺腫瘤的0.3%～0.9%，占纖維上皮性腫瘤的2%～3%[1]。PTB病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為與內(nèi)分泌激素紊亂、纖維腺瘤等因素有關(guān)，發(fā)病早期缺乏典型臨床癥狀，臨床診斷難度較大[2]。國內(nèi)研究表明，PTB復(fù)發(fā)率較高，惡性PTB轉(zhuǎn)移率較高，且多數(shù)由良性、交界性PTB演變而來[3]。數(shù)據(jù)顯示，良性、交界性、惡性PTB的發(fā)病率分別為21.7%、45.0%、90.0%，臨床鑒別和診斷的難度較大[4]。PTB的臨床治療以手術(shù)治療為主(以局部廣泛切除為主)，但具體術(shù)式選擇仍存在較大爭議[5]。腫瘤標(biāo)志物是指惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有特征性的異常物質(zhì)，能夠反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，監(jiān)測治療的反應(yīng)[6-7]。研究表明，Ki-67、CD34、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Desmin在惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平較高，在良性組織或正常組織中不表達(dá)，可通過免疫學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等方法測定[8]。本研究旨在探討Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin在PTB患者中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2016年9月在北京市大興區(qū)人民醫(yī)院行手術(shù)治療的371例PTB患者為研究對象，根據(jù)術(shù)后病理組織結(jié)果分為良性組、交界性組與惡性組。良性組325例，年齡33～67歲，平均(45±6)歲，病程1～12個月，平均(9.59±0.53)個月；交界性組32例，年齡34～69歲，平均(46±5)歲，病程0～18個月，平均(9.50±0.48)個月；惡性組14例，年齡43～68歲，平均(51±6)歲；病程1～13個月，平均(9.60±0.55)個月。各組年齡、病程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PTB診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并經(jīng)術(shù)后病理檢查確診；②患者均行手術(shù)治療，且患者均耐受手術(shù)；③患者意識清楚，能與醫(yī)師進(jìn)行溝通、交流。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并已確診的其他惡性腫瘤；②入院資料不全者；③合并認(rèn)知功能異常、精神異常者；④伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者；⑤術(shù)前行放療、化療、生物免疫治療者。

1.3方法

1.3.1儀器和試劑 生物組織自動脫水機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子研究所生產(chǎn)，型號：8T-12K)、病理組織包埋機(jī)(安徽省電子科學(xué)研究所生產(chǎn)，型號：BM-1型)、切片機(jī)(上海萊卡儀器有限公司生產(chǎn)，型號：LEICA RM2135)、切片漂烘溫控儀(安徽省電子科學(xué)研究所生產(chǎn)，型號：QP-B2)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus，型號：Olympus BX0)、鼠抗人Ki-67、CD34、SMA、Desmin單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn))。免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號：20187451)。

1.3.2檢測方法 患者術(shù)中均切除病灶組織與瘤旁組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin陽性比例。取術(shù)中病灶組織，以4%中性甲醛在常溫下固定，經(jīng)石蠟包埋后制備4 μm切片，向切片中加入3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin一抗(以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對照)，4 ℃下靜置12 h后，加入生物素標(biāo)記的Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin二抗，常溫下孵育10 min，利用二氨基聯(lián)苯胺顯色后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，利用中性樹膠常規(guī)封固。免疫組織化學(xué)染色下隨機(jī)取10個非重疊視野，完成細(xì)胞陽性比例計算[10-11]。Ki-67、CD34、SMA、Desmin陽性信號位于胞核、胞質(zhì)，計算Ki-67陽性細(xì)胞比例；無信號為0，弱于對照染色強(qiáng)度記為+，等于染色強(qiáng)度記為++，強(qiáng)于染色強(qiáng)度記為+++，并估算陽性區(qū)域百分比[12]。

1.4觀察指標(biāo) 比較各組Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin陽性率；所有患者術(shù)后均隨訪2～3年，并記錄患者治療預(yù)后情況；分析Ki-67、CD34、SMA、Desmin表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1三組Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin陽性率比較 三組Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，惡性組Ki-67陽率高于交界性組和良性組，且交界性組高于良性組(P<0.05)；惡性組CD34陽性率低于良性組和交界性組，交界性組、良性組CD34陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；惡性組α-SMA陽性率高于交界性組和良性組，且交界性組高于良性組(P<0.05)；惡性組Desmin陽性率高于交界性組和良性組(P<0.05)，交界性組和良性組Desmin陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。在PTB惡性組中，乳腺間質(zhì)CD34的表達(dá)減少(圖1a)，而間質(zhì)中α-SMA和Desmin呈灶狀陽性表達(dá)(圖1b、1c)，間質(zhì)以及上皮的Ki-67表達(dá)均顯著增加，局灶間質(zhì)表達(dá)高達(dá)30%(圖1d)。

表1 三組PTB患者Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin陽性率比較 [例(%)]

2.2三組復(fù)發(fā)率比較 對371例PTB患者術(shù)后2～3年的隨訪(電話或信件)顯示，348例患者最終確診，23例失訪，隨訪成功率為93.80%；其中17例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為4.58%；惡性組患者復(fù)發(fā)率高于交界性組和良性組，交界性組復(fù)發(fā)率高于良性組(P<0.05)，見表2。

圖1 惡性乳腺葉狀腫瘤CD34(a)、α-SMA(b)、Desmin(c)、Ki-67(d)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (蘇木精-伊紅染色，×200)

表2 三組PTB患者復(fù)發(fā)率比較 [例(%)]

2.3Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin表達(dá)與PTB術(shù)后復(fù)發(fā)率的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PTB患者Ki-67與復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)(r=0.792，P=0.031)，CD34、α-SMA、Desmin與復(fù)發(fā)率無相關(guān)性(r=0.121，P=0.098；r=0.229，P=0.596；r=0.193，P=0.552)。

3 討 論

PTB最早于1838年首次提出，是一組界限清楚的纖維上皮性腫瘤，組織學(xué)與管內(nèi)型纖維瘤相似，雙側(cè)上皮細(xì)胞沿裂隙排列，且周圍存在非常豐富的間質(zhì)或間充質(zhì)細(xì)胞成分，形成復(fù)雜的葉狀結(jié)構(gòu)[13-14]。臨床上，根據(jù)間質(zhì)細(xì)胞的豐富程度、核分裂象、細(xì)胞異型性及腫瘤邊界等組織學(xué)特征，將其分為良性、交界性和惡性，以良性居多，加強(qiáng)PTB病理檢查對確診PTB、指導(dǎo)PTB臨床治療具有重要意義。

Ki-67本質(zhì)上是一種核抗原，位于細(xì)胞核內(nèi)，出現(xiàn)在細(xì)胞G1、S、G2、M期，由于其半衰期較短，能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖活性[15]。Ki-67在免疫組織化學(xué)中主要以棕褐色顆粒為主，并位于細(xì)胞核內(nèi)。但Ki-67臨床使用時亦存在一定的局限性，其表達(dá)水平常受到炎癥、激素影響而發(fā)生變化，導(dǎo)致臨床診斷特異性較低。因此，臨床上單一的測定Ki-67并不能較好地反映患者疾病嚴(yán)重程度，難以為臨床診療提供參考依據(jù)。Ki67在細(xì)胞G1、S、G2和M期出現(xiàn)，其半衰期相對較短，能較好地反映細(xì)胞的增殖活性，通過免疫組織化學(xué)能完成組織中Ki-67表達(dá)，既往研究表明，與正常組織相比，良性PTB的Ki-67陽性率變化不明顯，而惡性PTB組織的Ki-67陽性率較高[16]，本研究結(jié)果與其一致。

CD34在乳腺纖維上皮性腫瘤中呈低表達(dá)，多源于梭形細(xì)胞。CD34在乳腺纖維上皮性腫瘤中的陽性表達(dá)降低，可能與成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞分化程度降低或細(xì)胞轉(zhuǎn)化等有關(guān)。既往研究表明，CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，能選擇性地表達(dá)于人類及其他哺乳動物造血干/祖細(xì)胞，并可隨著細(xì)胞成熟逐漸減弱或消失[17]。研究證實，CD34分子可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用，并可直接參與造血干細(xì)胞的運(yùn)輸、定植，亦可促進(jìn)炎癥反應(yīng)等[18]。另有研究表明，隨著細(xì)胞成熟，CD34表達(dá)水平逐漸降低，可見良性組織中CD34水平較穩(wěn)定，但惡性組織中CD34呈低表達(dá)[19]。本研究中，惡性組CD34陽性率低于交界性組、良性組，與上述研究結(jié)論一致。

α-SMA是一類形成微絲的球狀多功能蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞中，通過鈣黏蛋白的黏附連接與α-SMA、膜相互連接發(fā)揮作用。α-SMA屬于真核細(xì)胞骨架的必需元件，可發(fā)揮快速聚合、解聚等作用，通過為細(xì)胞提供細(xì)胞支持實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。α-SMA在正常人體中表達(dá)水平較低或不表達(dá)，但在PTB組織中呈高表達(dá)，尤其是惡性PTB組織。研究表明，α-SMA屬于肌肉結(jié)構(gòu)蛋白，在肌肉運(yùn)動中發(fā)揮重要作用，廣泛存在于橫紋肌肌原纖維中，亦可存在于平滑肌中[20-21]。本研究顯示，惡性組α-SMA陽性率高于交界性組、良性組，且交界性組α-SMA陽性率高于良性組，與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為α-SMA直接參與了惡性PTB的發(fā)生、發(fā)展。

Desmin亦是人體中較為重要的蛋白，在正常人體中表達(dá)水平較低，但在惡性葉狀腫瘤中呈高表達(dá)，可直接參與疾病發(fā)生、發(fā)展[22]。本研究結(jié)果顯示，惡性組Desmin陽性率高于交界性組、良性組，與上述研究結(jié)果一致。

PTB病因復(fù)雜，預(yù)后較差，本研究進(jìn)一步對PTB患者治療預(yù)后與Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，Ki-67、α-SMA、Desmin的陽性率均較高，均直接參與PTB的發(fā)生、發(fā)展；其中Ki-67水平與PTB復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，而CD34、α-SMA、Desmin水平與PTB復(fù)發(fā)率無相關(guān)性。因此，臨床盡早完善有關(guān)檢查，加強(qiáng)病理檢查，有助于PTB患者的早期確診；對于已確診PTB患者，應(yīng)及時采取有效治療措施，測定Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin蛋白水平，以評估患者預(yù)后，根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整治療方案，鞏固療效，促進(jìn)患者早期恢復(fù)。目前，臨床上對于PTB以手術(shù)治療為主，但是患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。本研究中，PTB復(fù)發(fā)率為4.58%(17/371)，且惡性組患者復(fù)發(fā)率高于交界性組、良性組，交界性組復(fù)發(fā)率高于良性組。

綜上所述，PTB患者Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin的表達(dá)水平陽性率存在明顯異常，且Ki-67水平與PTB復(fù)發(fā)相關(guān)，測定Ki-67、CD34、α-SMA、Desmin水平有助于PTB患者的預(yù)后評估，及時調(diào)整治療方案，對鞏固療效、促進(jìn)康復(fù)具有重要意義。