秦英剛，花寶金

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053)

我國(guó)肺癌發(fā)病率逐漸增加，目前已上升至惡性腫瘤首位。其中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總體發(fā)病率的80%，NSCLC完全切除術(shù)后的5年生存率為25%～30%，所有NSCLC患者5年生存率僅為16%左右[1]。NSCLC的治療方式包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療等。其中，中醫(yī)藥也是NSCLC治療不可或缺的組成部分。既往研究證實(shí)，中醫(yī)藥治療NSCLC能有效延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，減少或延緩術(shù)后復(fù)發(fā)，改善患者生活質(zhì)量以及減輕臨床癥狀等[2]。

對(duì)腫瘤患者預(yù)后做出準(zhǔn)確判斷是臨床的一項(xiàng)重要工作。以往大多是根據(jù)患者的分期、年齡、一般狀況等來綜合判斷。其中，影像學(xué)是最常用的手段。尤其是對(duì)于NSCLC，影像學(xué)檢查是NSCLC患者選擇治療方案、評(píng)價(jià)治療效果及判斷預(yù)后的主要依據(jù)。但隨著治療手段的增多，影像學(xué)的弊端日益顯現(xiàn)，已逐漸無法滿足眾多治療手段、精準(zhǔn)治療和腫瘤異質(zhì)性的要求[3]，迫切需要一種補(bǔ)充檢查手段來指導(dǎo)臨床選擇更好的治療方式。

播散入循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，稱之為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)。CTCs數(shù)量對(duì)多種腫瘤患者的預(yù)后具有獨(dú)特的價(jià)值，目前多數(shù)專家認(rèn)為CTCs檢測(cè)在以下幾個(gè)方面有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值：①臨床影像學(xué)分期之外的補(bǔ)充；②治療效果的輔助判斷和患者的預(yù)后分析[4-6]；③術(shù)后患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)[7-8]；④指導(dǎo)選擇治療方案和強(qiáng)度；⑤“實(shí)時(shí)活檢”以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的分子和基因特征[9-10]；⑥腫瘤轉(zhuǎn)移過程機(jī)制的闡述。為了初步探索CTCs在中藥參與治療的晚期NSCLC患者預(yù)后方面的應(yīng)用價(jià)值，本研究應(yīng)用免疫磁珠陰性分選結(jié)合免疫熒光染色技術(shù)對(duì)中藥參與治療的晚期NSCLC患者進(jìn)行相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2017年3月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院收治的63例晚期NSCLC患者為研究對(duì)象，按照治療方法不同分為中醫(yī)組(33例)和中西醫(yī)結(jié)合組(30例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的病理診斷，分期為ⅢB和Ⅳ期的NSCLC患者；②KPS評(píng)分在60分以上，預(yù)計(jì)生存期在3個(gè)月以上；③既往未接受過靜脈中藥治療及化療或間隔3個(gè)月以上或近期病情進(jìn)展；④有可評(píng)價(jià)的病灶；⑤患者均簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等器官/系統(tǒng)嚴(yán)重疾??；②兒童、孕婦和精神病患者，難以隨訪者。

1.2治療方法 中醫(yī)組：用0.9%氯化鈉注射液500 mL+艾迪注射液50～100 mL/d，連續(xù)靜脈滴注,14～21 d為1個(gè)周期。中西醫(yī)結(jié)合組：根據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥網(wǎng)絡(luò)非小細(xì)胞肺癌指南選擇一線化療方案(順鉑/卡鉑+長(zhǎng)春瑞濱、順鉑/卡鉑+紫杉醇、順鉑/卡鉑+多西紫杉醇、順鉑/卡鉑+吉西他濱4個(gè)方案選擇其一)，化療2個(gè)周期；中藥用法與中醫(yī)組相同。

1.3檢測(cè)指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1CTCs檢測(cè) 分別于治療開始前、治療1個(gè)周期后(第21天)各檢測(cè)一次CTCs，抽血時(shí)間波動(dòng)不超過3 d?？崭共杉忪o脈血7 mL，采用免疫磁珠陰性分選及熒光染色技術(shù)檢測(cè)CTCs。采血后立即輕柔顛倒混勻6～8次，室溫靜置。24 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞富集操作。CTCs判定標(biāo)準(zhǔn)：熒光染色為CK+/CD45-，DAPI+；有完整的胞膜胞核形態(tài)。

1.3.2影像學(xué)檢查 分別于治療開始前、治療兩個(gè)周期后進(jìn)行胸部CT、腹部B超或CT檢查，必要時(shí)進(jìn)行E-CT、頭顱CT等檢查。影像學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行[11]。有效：目標(biāo)病灶最大徑之和縮小30%以上，并且無新發(fā)病灶；進(jìn)展：目標(biāo)病灶最大徑之和增大25%以上，或者出現(xiàn)新發(fā)病灶；穩(wěn)定：目標(biāo)病灶最大徑之和增大<25%或者縮小不足30%。

1.3.3生存情況 每個(gè)月隨訪患者以判定總生存期(overall survival，OS)及無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)。OS為入組之日到患者死亡；PFS為入組之日到影像學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)展。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，預(yù)后因素分析采用Cox回歸分析，向前條件法；采用GraphPad Prism繪制生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者一般資料比較 兩組患者性別、年齡、臨床分期、病理類型、分化程度、KPS評(píng)分、辨證分型、既往治療比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2CTCs檢測(cè)結(jié)果 63例患者中基線檢測(cè)有50例CTCs呈陽(yáng)性，13例檢測(cè)結(jié)果為陰性，陽(yáng)性率為79.4%。每7毫升外周血樣本中，最多檢測(cè)出18個(gè)腫瘤細(xì)胞，總體均值為(5.75±4.71)個(gè)；所有陽(yáng)性患者的CTCs均值為(7.24±4.13)個(gè)。

2.3影像學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果 63例患者中60例完成了第2周期治療后的影像學(xué)評(píng)價(jià)。其中，中醫(yī)組初治患者6例，4例評(píng)價(jià)為進(jìn)展，2例穩(wěn)定；非初治患者25例，17例評(píng)價(jià)為進(jìn)展，8例評(píng)價(jià)為穩(wěn)定。中西醫(yī)結(jié)合組，初治患者12例，4例影像學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)展，4例為穩(wěn)定，4例為緩解；非初治患者17例，10例影像學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)展，7例為穩(wěn)定。影像學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)展的患者35例，有效(穩(wěn)定+緩解)的患者25例。

表1 兩組晚期NSCLC患者一般資料比較 [例(%)]

2.4NSCLC生存預(yù)后的影響因素分析 所有63例入組患者中3例未完成治療，1例意外死亡，未納入統(tǒng)計(jì)。每月隨訪，以判定患者OS和PFS，中位隨訪206 d，失訪3例，期間死亡40例。對(duì)可能影響患者生存的因素量化賦值，賦值結(jié)果見表2。采用向前條件法，P≤0.05進(jìn)入模型，P≥0.10則移除。結(jié)果共有4項(xiàng)因素進(jìn)入Cox分析模型。結(jié)果顯示，基線CTCs、臨床分期、影像學(xué)評(píng)價(jià)、KPS評(píng)分為患者總生存的影響因素(P<0.05)，每增加1個(gè)CTCs(7 mL)，患者的死亡危險(xiǎn)約是以前的2.618倍；臨床分期為Ⅳ期患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是ⅢB期的3.102倍；2周期后影像學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)展的患者，死亡風(fēng)險(xiǎn)約是評(píng)價(jià)為有效的3.112倍；KPS評(píng)分每減少10分，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加約1.137倍。見表3。

表2 自變量賦值

表3 影響晚期NSCLC生存預(yù)后的Cox回歸分析

2.5基線CTCs數(shù)量對(duì)OS的影響 以總體CTCs數(shù)量的均值為截點(diǎn)，對(duì)CTCs數(shù)量>5個(gè)和≤5個(gè)的兩組患者進(jìn)行生存曲線比較。CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者28例，刪失2例(7.1%)；CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者31例，刪失17例(54.8%)。CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者平均OS為228.10 d(95%CI204.47～251.73)，中位OS為236.00 d(95%CI185.44～285.56)；CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者平均OS為339.70 d(95%CI331.12～348.29)，由于刪失數(shù)較多，未列出中位OS。CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者OS短于CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者(χ2=59.960，P<0.001)。見圖1。

2.6第1周期治療后CTCs數(shù)量與PFS的關(guān)系 對(duì)其中20例影像學(xué)評(píng)價(jià)為有效(穩(wěn)定+緩解)且進(jìn)行規(guī)律復(fù)查的患者進(jìn)行疾病PFS和第1周期治療后CTCs數(shù)量關(guān)系分析。將CTCs數(shù)量分為>5個(gè)和≤5個(gè)兩組，第1周期治療后CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者8例，刪失1例(12.5%)；CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者12例，無刪失病例。CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者平均PFS為81.63 d(95%CI63.87～99.38)，中位PFS為64.00 d(95%CI58.46～69.54)；而CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者平均PFS為167.42 d(95%CI145.39～189.45)，中位PFS為172.00 d(95%CI158.42～185.58)。第1周期治療后CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者PFS短于CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者(χ2=15.350，P<0.001) 。見圖2。

CTCs循環(huán)腫瘤細(xì)胞；OS：總生存期圖1 基線CTCs與OS的生存函數(shù)

CTCs：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；PFS：無進(jìn)展生存期圖2 治療1個(gè)周期后CTCs與PFS的生存函數(shù)

2.7不同CTCs數(shù)量條件下不同治療方式對(duì)OS的影響

2.7.1CTCs數(shù)量>5個(gè)時(shí)各組的生存函數(shù) 當(dāng)基線CTCs數(shù)量>5個(gè)時(shí)，中醫(yī)組14例，無刪失病例；中西結(jié)合醫(yī)組14例，刪失2例(14.3%)。中醫(yī)組平均OS為202.93 d(95%CI168.55～237.31)，中位OS為205.00 d(95%CI153.66～256.34)；中西醫(yī)結(jié)合組平均OS為253.46 d(95%CI225.74～281.19)，中位OS為262.00 d(95%CI232.67～291.34)，兩組生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.348，P=0.125)。見圖3。

CTCs：循環(huán)腫瘤細(xì)胞;OS:總生存期圖3 CTCs數(shù)量>5個(gè)時(shí)各組的生存函數(shù)

2.7.2CTCs數(shù)量≤5個(gè)時(shí)各組的生存函數(shù) 當(dāng)基線CTCs數(shù)量≤5個(gè)時(shí)，中醫(yī)組15例，刪失8例(53.3%)；中西醫(yī)結(jié)合組16例，刪失9例(56.3%)。中醫(yī)組平均OS為334.73 d(95%CI319.58～349.88)，中西醫(yī)結(jié)合組患者平均OS為344.07 d(95%CI335.93～352.21)，兩組生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.496，P=0.572)。見圖4。

CTCs：循環(huán)腫瘤細(xì)胞;OS:總生存期圖4 CTCs數(shù)量≤5個(gè)時(shí)各組的生存函數(shù)

3 討 論

中西醫(yī)結(jié)合治療在多數(shù)疾病的治療中能取得最好的臨床效果，因?yàn)閮烧呖梢匀￠L(zhǎng)補(bǔ)短。但也可能導(dǎo)致過度治療。如NSCLC早期術(shù)后患者，輔助化療不一定能使患者受益，單純中藥治療是一種可以選擇的方式；部分老年晚期NSCLC患者身體一般狀況差，此時(shí)高強(qiáng)度的治療并不一定使總生存受益。因此，應(yīng)考慮采用更好的檢測(cè)方式來判斷患者的預(yù)后，以采用針對(duì)性的治療。

中醫(yī)藥參與治療對(duì)NSCLC患者的生存益處已經(jīng)得到了眾多大規(guī)模、多中心研究的驗(yàn)證。研究證實(shí)，中醫(yī)藥在延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、減少或延緩術(shù)后復(fù)發(fā)、改善生活質(zhì)量及減輕臨床癥狀等方面有獨(dú)特的作用[12]。但是中醫(yī)藥發(fā)揮有益作用的機(jī)制至今仍未闡明?，F(xiàn)有的結(jié)果表明，中醫(yī)藥具有多種作用：能調(diào)劑人體免疫，扶助人體正氣，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[13-14]；可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用；可以調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，從而起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用；可以對(duì)肺癌新生血管產(chǎn)生影響，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)；活血化瘀類中藥可影響腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子表達(dá)等[15-18]?？梢钥闯觯嗅t(yī)對(duì)腫瘤的治療可能是一種多靶點(diǎn)、系統(tǒng)性的調(diào)節(jié)，中醫(yī)的辨證論治和整體觀是對(duì)機(jī)體狀態(tài)的全面把握，很難從一個(gè)點(diǎn)、一個(gè)方面去完全闡釋中醫(yī)藥的作用機(jī)制。

因此，需要一個(gè)能比較全面代表腫瘤治療效果的方法，而鑒于CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)展、預(yù)后的重要參與者，其在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。有研究在乳腺癌[19-21]、結(jié)直腸癌[22]、前列腺癌[23]等患者的不同治療階段充分證明了CTCs的生存預(yù)測(cè)價(jià)值，這也是目前美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)其臨床應(yīng)用的原因。部分研究結(jié)果顯示，CTCs數(shù)量的生存預(yù)測(cè)價(jià)值甚至超過了影像學(xué)檢查的作用；在部分腫瘤早期患者術(shù)后復(fù)發(fā)中的預(yù)測(cè)價(jià)值也超出了預(yù)估[24-25]。

對(duì)患者預(yù)后的準(zhǔn)確評(píng)估是指導(dǎo)治療方案制定的重要因素，既有效避免無效治療，也能使患者得到應(yīng)有的治療。本研究多因素Cox回歸生存分析顯示，基線CTCs數(shù)量、臨床分期、影像學(xué)評(píng)價(jià)、KPS評(píng)分為患者總生存的影響因素，由于CTCs數(shù)量的浮動(dòng)范圍最大，因此實(shí)際上CTCs數(shù)量在影響生存的各個(gè)因素中最為重要。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，第1周期治療后與CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者相比，CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者疾病PFS更短。這提示可以根據(jù)CTCs數(shù)量來判斷哪些患者更需要維持治療。本研究結(jié)果顯示，基線CTCs數(shù)量>5個(gè)的患者接受中西醫(yī)結(jié)合治療有獲得更長(zhǎng)生存的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；基線CTCs數(shù)量≤5個(gè)的患者，中醫(yī)治療和中西醫(yī)結(jié)合治療總生存相似。因?yàn)镃TCs數(shù)量越多，患者預(yù)后越差，在患者身體狀況允許的情況下，應(yīng)該采取更高強(qiáng)度的治療方式。既往研究多數(shù)證實(shí)CTCs在多種實(shí)體腫瘤中判斷預(yù)后的價(jià)值[26-27]，本研究結(jié)果也與上述研究結(jié)論相符。但根據(jù)CTCs數(shù)量選擇不同的治療方式是否能使患者獲益仍沒有定論，有待更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

總之，CTCs在晚期NSCLC患者中具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值，無論是對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)還是治療方式的選擇均值得進(jìn)一步探索。從技術(shù)能力角度分析，各種技術(shù)的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，同時(shí)腫瘤的異質(zhì)性、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤微栓子、腫瘤干細(xì)胞等現(xiàn)象對(duì)CTCs檢測(cè)準(zhǔn)確性的干擾都對(duì)CTCs的檢測(cè)提出了更高的要求[28-30]，CTCs檢測(cè)需要在提高檢測(cè)手段的靈敏性和穩(wěn)定性以及降低檢測(cè)費(fèi)用方面取得突破，才能更好地推動(dòng)CTCs檢測(cè)的臨床應(yīng)用。