韓多紅，王恩軍，張 勇，王紅霞，王 艷，王 富

(1.河西學院 生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(LyciumrutheniumMurr.)，為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生植物，耐旱、耐鹽堿，主要分布于我國西北干旱荒漠區(qū)的荒地和鹽堿化土地上。黑果枸杞果實入藥，其味甘、性平，是民族醫(yī)藥中的常用藥材，據(jù)《晶珠草本》、《四部醫(yī)典》記載，可治療心熱病、心臟病等病癥[1]。干旱是限制植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，每年導致作物減產(chǎn)幅度可達30%～70%左右。干旱會引起植物組織水分虧缺，導致植物出現(xiàn)萎蔫，光合作用減弱，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，氧自由基增多，引起膜脂過氧化作用，造成膜系統(tǒng)損傷。干旱條件下，由土壤溶液水勢下降導致的滲透脅迫會使活性氧(ROS)過量積累而對植物產(chǎn)生過氧化損傷，進而破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)，使其喪失生理功能，嚴重影響植株發(fā)育，甚至造成死亡[2]。

稀土微肥(Rare earth elements，REE)是稀土元素(原子序數(shù)從57到71的鑭系元素以及與鑭系元素性質(zhì)極為相似的釔、鈧等17種元素)肥料的簡稱[3]。近年來，REE已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，實踐表明REE可促進植物生長發(fā)育，提高種子萌發(fā)能力，增加產(chǎn)量，增強抗逆性等。已有研究表明，適量REE可促進植物生長發(fā)育[4]，緩解重金屬脅迫[5]，提高耐鹽性[6-7]，抗旱性[8]等。黑果枸杞的果實在西北地區(qū)常作為藏藥、維藥等大量使用，其富含花青素，可增強免疫力，減緩細胞氧化[9]。目前，黑果枸杞人工栽培的數(shù)量較少，多數(shù)均為野生狀態(tài)，其果實產(chǎn)量較少，不能滿足用藥需求。本研究用聚乙二醇-6000(PEG-6000)模擬干旱對黑果枸杞幼苗進行脅迫，然后根施REE進行緩解處理，測定丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)等生理指標，探討幼苗中抗氧化酶體系、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的生理響應(yīng)，以期為黑果枸杞在干旱及半干旱地區(qū)的引種馴化和抗旱生理機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年11月在張掖市甘州區(qū)堿灘鄉(xiāng)荒灘地上，采集多年生、野生狀態(tài)的黑果枸杞果實，帶回實驗室洗出種子，自然晾干。供試REE為水溶肥內(nèi)含，由包頭市華農(nóng)士稀土肥業(yè)有限公司提供。

稀土微肥里央含有稀土元素和其它微量元素，共2大類。其中稀土元素有銅系元素：鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)，以及與鑭系的15個元素密切相關(guān)的兩個元素，鈧(Sc)和釔(Y)共17種元素，統(tǒng)稱為稀土元素。微量元素有：鐵、鋅、錳、鉬、硼等。

1.2 方法

精選黑果枸杞種子，用2% NaClO浸泡消毒5 min，蒸餾水沖洗干凈。放入22±1 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸種催芽，待種子露白后播種于口徑、高為8 cm×8 cm的育苗缽內(nèi)，育苗缽內(nèi)填充蛭石，在人工光照氣候室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23±1 ℃，濕度70%，光照3000 Lx，用1/4的Hoagland營養(yǎng)液等量澆灌。當幼苗長至2葉1心時，每缽定苗15株，3個重復(fù)，在幼苗生長50 d，8 cm高時進行處理。設(shè)定PEG-6000的濃度為：0、5、10、15、20和30%共6個處理，REE濃度為0.3%(表1)。采用灌根(根施)方式，每次每缽用量5 mL，每天2次，以蒸餾水為對照，處理7 d后，取地上部分測定葉綠素、MDA含量和保護酶活性等生理指標。

表1 試驗處理

1.3 測定指標

葉綠素含量采用TYS-A型葉綠素測定儀測定[10]；游離Pro含量采用酸性茚三酮顯色法測定[10]；MDA含量用TBA法進行測定[10]；過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性分別用愈創(chuàng)木酚法、氮藍四唑(NBT)顯色法和紫外吸收法測定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表達，用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(one-way ANOVA) 和LSD法進行多重比較(P<0.05)，Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 REE處理對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗葉綠素含量的影響

由圖1可知，在5%～30%的PEG脅迫下，幼苗中葉綠素含量隨PEG濃度增大而降低，兩者間呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.9949)；T5處理的葉綠素含量降幅最大，比CK降低74.96%；T2～T5處理與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。在根施0.3%REE處理后，幼苗中葉綠素含量均高于相應(yīng)PEG處理組，T1～T3處理的增幅較小，T4～T5處理的增幅較大，其T增幅最大為41.4%。這表明根施REE可促進光合色素含量增加，有效緩解了干旱脅迫對光合色素合成的抑制作用。

圖1 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗葉綠素含量的影響

2.2 REE處理對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗Pro含量的影響

由圖2可知，在5%～30%PEG脅迫下，T1～T5處理的Pro含量均高于CK，其中T4較CK增加的幅度最大，為290.57%；T1較CK增加的幅度最小，為6.18%，且兩者間無顯著性差異(P>0.05)。在根施0.3%PEE處理后，Pro含量較PEG處理組均出現(xiàn)升高，但T1～T2的升幅較小，T3～T5的升幅較大，其中T4升幅最大為32.43%。這表明根施REE可進一步提高干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量積累，防止細胞脫水。

圖2 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗脯氨酸含量的影響

2.3 REE處理對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗MDA含量的影響

由圖3可知，PEG處理使黑果枸杞幼苗膜脂過氧化程度加劇，MDA含量隨PEG濃度升高而增大，與PEG濃度呈極顯著正相關(guān)性(r=0.9955，P<0.01)；T5處理的MDA含量較CK升高了147.99%；T1與CK間無顯著性差異(P>0.05)，T2～T5與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。在根施0.3%REE處理后，幼苗中MDA含量顯著降低，且均低于相應(yīng)的PEG處理。表明根施REE可一定程度的減輕干旱脅迫下細胞膜的過氧化作用，保護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

圖3 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗丙二醛含量的影響

2.4 REE處理對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗SOD、POD、CAT活性的影響

由圖4可知，在5%～30%的PEG脅迫下，幼苗中SOD活性出現(xiàn)“先升后降”的現(xiàn)象；T4處理的SOD活性增幅最大，T1增幅最小，分別較CK增加149.13%、7.24%；在根施0.3%REE處理后，幼苗中SOD活性較PEG處理組出現(xiàn)了顯著升高，其中T1～T3處理的幅度較小，T4、T5幅度較大；T1～T5處理與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖4 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗SOD活性的影響

由圖5可知，黑果枸杞幼苗中POD活性隨PEG脅迫程度的加劇呈現(xiàn)“先上升，后下降”的趨勢；T4處理的POD活性最大，較CK增加114.23%；T1較CK增加6.92%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)。在根施0.3%REE處理后，幼苗中POD活性較PEG處理組出現(xiàn)了升高，其中T3、T4處理升高幅度較大，為15.05%、20.68%，T1幅度最小為6.3%。T1～T5與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗POD活性的影響

由圖6可知，隨著PEG、PEG + REE處理濃度的增大，幼苗中的CAT活性在T1～T4處理時不斷升高，T5開始下降。T4時，PEG、PEG + REE處理分別較CK增加了136.68%、208.15%。在PEG處理下，T1與CK間無顯著性差異(P>0.05)，而在PEG + REE處理下，T1～T5與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。與PEG處理組相比，PEG + REE處理的幼苗中CAT活性均出現(xiàn)了不同程度的增加，T4時增幅最大，較PEG處理增大了36.15%。

圖6 稀土微肥對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗CAT活性的影響

3 討論

光合作用是植物生長的基礎(chǔ)，葉綠素含量在一定程度上可以反映植物的光合能力[12]。干旱脅迫下，植物的光合速率會顯著下降，光合色素含量下降，葉綠體結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)遭到破壞。本研究中，干旱脅迫使黑果枸杞幼苗葉綠素含量顯著下降，根施0.3%REE后，干旱脅迫下的幼苗葉綠素含量均出現(xiàn)了不同幅度的升高，但重度干旱脅迫處理組升高的幅度較大，表明根施REE可一定程度保護葉綠素結(jié)構(gòu)的完整性，且對重度干旱脅迫的緩解效果好于輕度干旱脅迫。

干旱脅迫可引起細胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)紊亂，導致活性氧自由基顯著積累，膜脂過氧化加劇，其中過氧化產(chǎn)物MDA可作為膜脂過氧化損害程度和抗旱能力的重要指標，其含量的高低反應(yīng)了植物細胞受害程度[13]。本研究中，黑果枸杞幼苗在不同程度的干旱脅迫后均導致MDA含量增加，其增幅隨干旱脅迫程度的加劇而增大。根施0.3%REE后，幼苗中MDA含量顯著降低，表明REE有效的降低了膜脂過氧化程度，提高了膜的穩(wěn)定性。

滲透調(diào)節(jié)是植物抵御干旱的一種重要方式，植物可通過提高細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來維持膨壓，防止細胞失水，保持膜結(jié)構(gòu)的完整性。Pro作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，既可用于保持胞質(zhì)溶膠與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，還可與蛋白質(zhì)相互作用增強蛋白質(zhì)的可溶性，提高植物的耐旱能力。本研究中，干旱脅迫下黑果枸杞幼苗中含量出現(xiàn)了一定幅度的增加，在根施0.3%REE后，幼苗中Pro含量進一步顯著增加，說明根施REE能夠有效提高細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強植物對干旱脅迫的適應(yīng)能力。

SOD、POD和CAT是植物細胞中清除ROS最重要的抗氧化酶，通過相互協(xié)調(diào)，共同協(xié)作能有效清除ROS，維持體內(nèi)的ROS代謝平衡[14]。本研究中，在輕(中度)的干旱脅迫下(PEG<20%)，黑果枸杞幼苗中SOD、POD和CAT活性均升高，但在重度干旱脅迫下(PEG≥30%)，SOD等抗氧化酶的活性降低。原因可能是干旱脅迫下ROS作為信號分子，誘導細胞抗氧化酶系統(tǒng)基因表達，幼苗通過提高保護酶活性來增強耐旱性，但當細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS過多時，其超出了抗氧化酶的清除能力，細胞受到了傷害。在根施0.3%REE后，SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)了一定幅度的提高，表明REE能夠通過激活或維持活性氧清除酶類的活性，抑制ROS的產(chǎn)量，減弱干旱脅迫對細胞造成的傷害，這與許鎖鏈等[15]對小桐子的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

黑果枸杞具有一定的耐旱性，輕(中度)的干旱脅迫(PEG<20%)對其造成的傷害較小，重度干旱脅迫(PEG≥30%)的傷害較大，根施0.3%的稀土微肥可有效的緩解干旱脅迫傷害，尤其對重度干旱脅迫的緩解效果較為顯著。