朱戈麗，伍 軍，張艷霞，封寶紅，畢智敏，鞏雪敏，李 靜

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病較嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，是慢性腎衰竭患者行血液透析或腎臟移植的首要因素[1]。DN典型的病理改變?yōu)槟I小球、腎小管上皮細(xì)胞增大，細(xì)胞外基質(zhì)增多，晚期進(jìn)展為腎小球硬化[2]。但DN的具體發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，大部分學(xué)者認(rèn)為與代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等有關(guān)[3]。近年發(fā)現(xiàn)microRNA在個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞增殖與凋亡等多個(gè)過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[4]。研究表明，多種microRNA在腎臟中均有表達(dá)，且與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。大量研究證實(shí)miR-21可能是DN的潛在分子靶點(diǎn)[6-7]。PTEN/SMAD7是miR-21下游重要的靶蛋白，但國(guó)內(nèi)基于miR-21介導(dǎo)PTEN/SMAD7信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控DN的相關(guān)研究較少，故本研究通過(guò)建立DN大鼠模型，分析miR-21介導(dǎo)PTEN/SMAD7信號(hào)傳導(dǎo)通路在DN大鼠腎纖維化中的作用及其機(jī)制，為臨床DN的診斷與防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例選取 收集2018年6月—2019年3月武漢市第三醫(yī)院就診的DN患者45例和體檢健康者30例的血清樣本，納入標(biāo)準(zhǔn)：DN患者符合DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；體檢健康者各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)均正常；年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、腦血管疾??；合并糖尿病酮癥酸中毒者；合并惡性腫瘤、自身免疫功能障礙等慢性疾病者；存在影響血miR-21水平因素者。DN患者中男26例，女19例；年齡53～76(62.39±9.85)歲。體檢健康者中男18例，女12例；年齡55～78(63.72±8.79)歲。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0004]的雄性SPF級(jí)SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3試劑與儀器 高糖高脂飼料購(gòu)自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，慢病毒載體、miR-21慢病毒、引物序列購(gòu)自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司，SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自德國(guó)Merck millipore公司，BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司。

1.4研究方法

1.4.1動(dòng)物分組、建模及處理：48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Blank組)、DN組、空載慢病毒組(Empty vector組)和沉默miR-21組(miR-21-shRNA組)，每組12只。Blank組給予正常飼料，其他組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，尾靜脈注射30 mg/kg STZ構(gòu)建DN大鼠模型，72 h后檢測(cè)大鼠血糖，若血糖≥16.7 mmol/L提示DN動(dòng)物模型構(gòu)建成功[9]，均造模成功。造模成功后第1、5、9周Empty vector組和miR-21-shRNA組分別尾靜脈注射空載慢病毒液和miR-21慢病毒液，感染復(fù)數(shù)均為100；Blank組和DN組以等量0.9%氯化鈉注射液替代。于建模成功后第12周采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，收集大鼠尾動(dòng)脈血液3 ml和雙側(cè)腎臟組織。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)DN患者和體檢健康者血清和大鼠腎組織中miR-21的表達(dá)：血液樣本進(jìn)行抗凝處理后，小心分離淋巴細(xì)胞，加入TRIzol裂解液；取各組大鼠適量腎臟組織，加入TRIzol裂解液，以氯仿-異丙醇體系提取樣品總RNA，經(jīng)微量核酸儀檢測(cè)其純度和濃度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性；參照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，合成cDNA模板；混入SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。miR-21的上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物為5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；內(nèi)參基因U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。參數(shù)設(shè)置：95℃ 30 s，95℃ 10 s,60℃ 34 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算樣品中miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3腎功能指標(biāo)檢測(cè)：將大鼠血液以2000 r/min離心10 min，分離上層血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清肌酐(SCr)、尿素(BUN)含量。

1.4.4腎組織病理變化觀察：將各組大鼠腎臟組織制成石蠟組織切片行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理組織變化和纖維化程度。

1.4.5Western blot法檢測(cè)大鼠腎組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)：采用放射免疫沉淀分析裂解液提取腎組織粉末中總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度；取適量蛋白樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；再浸于5%脫脂奶粉中封閉，37℃下孵育1 h；加入I型膠原(Col I)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及SMAD7蛋白一抗，4℃下孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min；經(jīng)化學(xué)發(fā)光后觀察蛋白條帶，利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN及SMAD7蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 體檢健康者血清中miR-21表達(dá)量為1.06±0.13，DN患者miR-21表達(dá)量為2.67±0.32，DN患者血清miR-21水平明顯高于體檢健康者(t=26.111，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 DN為糖尿病腎?。慌c健康者比較，bP<0.01

2.2沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織中miR-21水平影響 與Blank組比較，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中miR-21水平明顯升高(P<0.01)；與DN組比較，miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01)，但Empty vector組miR-21水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織miR-21的影響

2.3沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎功能指標(biāo)的影響 與Blank組相比，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組SCr水平明顯升高(P<0.05)，DN組和Empty vector組BUN水平明顯升高(P<0.01)；與DN組相比，miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但Empty vector組上述指標(biāo)水平無(wú)明顯改變(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎功能指標(biāo)的影響

2.4沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織病理變化的影響 HE染色顯示，Blank組腎組織中腎小球、間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞數(shù)量和基質(zhì)分布無(wú)明顯改變；DN組腎小球明顯增大，系膜細(xì)胞增殖明顯，間質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞伴有壞死、萎縮；與DN組比較，miR-21-shRNA組上述病理改變明顯減輕，但Empty vector組與DN組無(wú)明顯差異。Masson染色顯示，Blank組腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)均發(fā)生異常變化；DN組腎小球基質(zhì)中膠原纖維顯著增加，纖維組織增多；與DN組相比，miR-21-shRNA組纖維化程度減輕，但Empty vector組無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖2。

圖2 沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織病理變化的影響(×400) Blank組為空白對(duì)照組，DN組為糖尿病腎病組，Empty vector組為空載慢病毒組，miR-21-shRNA組為沉默miR-21組

2.5沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Blank組相比，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，PTEN和SMAD7表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與DN組相比，miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，PTEN和SMAD7表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，但Empty vector組Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN和SMAD7表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，PTEN和SMAD7表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 沉默miR-21對(duì)各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

miRNA是體內(nèi)高度保守、非編碼的小RNA分子，廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中，但存在差異性表達(dá)[10]。數(shù)據(jù)表明，miRNA在DN中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。本研究采用qRT-PCR檢測(cè)DN患者和體檢健康者血清中miR-21的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-21在DN患者中的表達(dá)明顯高于體檢健康者，提示miR-21可能參與DN的發(fā)病過(guò)程，與McClelland等[12]研究結(jié)果一致。但miR-21在DN中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，miR-21調(diào)控作用研究已在各領(lǐng)域中展開(kāi)。腫瘤方面研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是一種潛在的促癌基因，與腎癌、胃癌、肺癌等多種癌癥密切相關(guān)，且相關(guān)機(jī)制研究較多[13]。心血管系統(tǒng)方面研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。Wang等[15]研究顯示，miR-21在DN中過(guò)表達(dá)，可介導(dǎo)TGF-β1加劇腎損傷。本研究通過(guò)高糖高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)DN大鼠模型，驗(yàn)證了miR-21在DN中的作用。同時(shí)，抑制miR-21的表達(dá)可顯著改善DN大鼠腎組織病理?yè)p傷，降低血清SCr、BUN水平，進(jìn)一步說(shuō)明miR-21可能參與了DN的發(fā)展過(guò)程。

Bao等[16]研究顯示，miR-21通過(guò)作用于下游靶基因，來(lái)減少細(xì)胞外基質(zhì)降解、促進(jìn)腎臟間質(zhì)肥大和系膜基質(zhì)沉積，加劇腎臟組織纖維化，但國(guó)內(nèi)尚缺乏相關(guān)報(bào)道。PTEN基因是蛋白激酶(AKT)的負(fù)性調(diào)節(jié)器，通過(guò)將磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的第3位脫磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?,5-二磷酸磷脂酰肌醇，從而抑制AKT活性，阻斷PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路，而參與多種生命活動(dòng)過(guò)程。Sekar等[17]觀察到OVE26 Ⅰ型糖尿病小鼠的系膜細(xì)胞中miR-21異常高表達(dá)，隨著病程的遷延，其腎臟組織中miR-21表達(dá)也逐漸升高；同時(shí)，高表達(dá)的miR-21會(huì)抑制PTEN的表達(dá)，敲低miR-21表達(dá)后PTEN表達(dá)增加，說(shuō)明高血糖可引起腎臟組織中miR-21表達(dá)的增加，抑制 PTEN 蛋白表達(dá)可加劇腎纖維化。另外，細(xì)胞外基質(zhì)沉積也是DN重要的病理表現(xiàn)之一。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可能經(jīng)介導(dǎo)SMAD7調(diào)節(jié)腎損傷，敲除miR-21恢復(fù)腎組織中SMAD7水平，并抑制TGF-β1和核轉(zhuǎn)錄因子活化，從而改善腎纖維化程度。本研究顯示，DN大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的纖維化，且Col I、MMP-2及TGF-β1的表達(dá)明顯上調(diào)，PTEN和SMAD7的表達(dá)明顯下調(diào)；而沉默miR-21后，腎纖維化程度降低，Col I、MMP-2及TGF-β1的表達(dá)顯著下調(diào)，PTEN和SMAD7的表達(dá)明顯上調(diào)，提示miR-21可能通過(guò)抑制PTEN/SMAD7信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，引起DN大鼠腎纖維化，與上述研究結(jié)果相符。

綜上所述，干擾miR-21的表達(dá)可作為治療DN的潛在策略，其可能通過(guò)PTEN/SMAD7信號(hào)傳導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)腎組織纖維化，但DN不同階段與miR-21的關(guān)系還需大量臨床研究驗(yàn)證。