朱戈麗,伍 軍,張艷霞,封寶紅,畢智敏,鞏雪敏,李 靜
糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病較嚴(yán)重的一種并發(fā)癥,是慢性腎衰竭患者行血液透析或腎臟移植的首要因素[1]。DN典型的病理改變?yōu)槟I小球、腎小管上皮細(xì)胞增大,細(xì)胞外基質(zhì)增多,晚期進(jìn)展為腎小球硬化[2]。但DN的具體發(fā)病機制尚未研究清楚,大部分學(xué)者認(rèn)為與代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等有關(guān)[3]。近年發(fā)現(xiàn)microRNA在個體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞增殖與凋亡等多個過程中起重要的調(diào)控作用[4]。研究表明,多種microRNA在腎臟中均有表達(dá),且與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。大量研究證實miR-21可能是DN的潛在分子靶點[6-7]。PTEN/SMAD7是miR-21下游重要的靶蛋白,但國內(nèi)基于miR-21介導(dǎo)PTEN/SMAD7信號傳導(dǎo)通路調(diào)控DN的相關(guān)研究較少,故本研究通過建立DN大鼠模型,分析miR-21介導(dǎo)PTEN/SMAD7信號傳導(dǎo)通路在DN大鼠腎纖維化中的作用及其機制,為臨床DN的診斷與防治提供依據(jù)。
1.1病例選取 收集2018年6月—2019年3月武漢市第三醫(yī)院就診的DN患者45例和體檢健康者30例的血清樣本,納入標(biāo)準(zhǔn):DN患者符合DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];體檢健康者各項實驗室生化指標(biāo)均正常;年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):合并心、腦血管疾??;合并糖尿病酮癥酸中毒者;合并惡性腫瘤、自身免疫功能障礙等慢性疾病者;存在影響血miR-21水平因素者。DN患者中男26例,女19例;年齡53~76(62.39±9.85)歲。體檢健康者中男18例,女12例;年齡55~78(63.72±8.79)歲。
1.2實驗動物 實驗動物為浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供[動物許可證號:SCXK(浙)2019-0004]的雄性SPF級SD大鼠48只,6~8周齡,體質(zhì)量180~220 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。
1.3試劑與儀器 高糖高脂飼料購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司,鏈脲佐菌素(STZ)購自上海源葉生物科技有限公司,慢病毒載體、miR-21慢病毒、引物序列購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司,miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司,SYBR Green qPCR Master Mix購自德國Merck millipore公司,BCA試劑盒購自美國Sigma公司,蛋白一抗購自美國Abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購自美國Thermo Fisher公司,全自動生化分析儀購自中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司。
1.4研究方法
1.4.1動物分組、建模及處理:48只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組(Blank組)、DN組、空載慢病毒組(Empty vector組)和沉默miR-21組(miR-21-shRNA組),每組12只。Blank組給予正常飼料,其他組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后,尾靜脈注射30 mg/kg STZ構(gòu)建DN大鼠模型,72 h后檢測大鼠血糖,若血糖≥16.7 mmol/L提示DN動物模型構(gòu)建成功[9],均造模成功。造模成功后第1、5、9周Empty vector組和miR-21-shRNA組分別尾靜脈注射空載慢病毒液和miR-21慢病毒液,感染復(fù)數(shù)均為100;Blank組和DN組以等量0.9%氯化鈉注射液替代。于建模成功后第12周采用頸椎脫臼法處死各組大鼠,收集大鼠尾動脈血液3 ml和雙側(cè)腎臟組織。
1.4.2實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測DN患者和體檢健康者血清和大鼠腎組織中miR-21的表達(dá):血液樣本進(jìn)行抗凝處理后,小心分離淋巴細(xì)胞,加入TRIzol裂解液;取各組大鼠適量腎臟組織,加入TRIzol裂解液,以氯仿-異丙醇體系提取樣品總RNA,經(jīng)微量核酸儀檢測其純度和濃度,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性;參照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作,合成cDNA模板;混入SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測。miR-21的上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3',下游引物為5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3';內(nèi)參基因U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。參數(shù)設(shè)置:95℃ 30 s,95℃ 10 s,60℃ 34 s,72℃ 1 min,共40個循環(huán)。采用2-△△CT法計算樣品中miR-21相對表達(dá)量。
1.4.3腎功能指標(biāo)檢測:將大鼠血液以2000 r/min離心10 min,分離上層血清,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠血清肌酐(SCr)、尿素(BUN)含量。
1.4.4腎組織病理變化觀察:將各組大鼠腎臟組織制成石蠟組織切片行常規(guī)HE染色和Masson染色,光鏡下觀察腎臟病理組織變化和纖維化程度。
1.4.5Western blot法檢測大鼠腎組織中相關(guān)蛋白的表達(dá):采用放射免疫沉淀分析裂解液提取腎組織粉末中總蛋白,經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度;取適量蛋白樣品,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;再浸于5%脫脂奶粉中封閉,37℃下孵育1 h;加入I型膠原(Col I)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及SMAD7蛋白一抗,4℃下孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育30 min;經(jīng)化學(xué)發(fā)光后觀察蛋白條帶,利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析,以β-actin為內(nèi)參,計算Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN及SMAD7蛋白相對表達(dá)量。
2.1DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 體檢健康者血清中miR-21表達(dá)量為1.06±0.13,DN患者miR-21表達(dá)量為2.67±0.32,DN患者血清miR-21水平明顯高于體檢健康者(t=26.111,P<0.001)。見圖1。
圖1 DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 DN為糖尿病腎??;與健康者比較,bP<0.01
2.2沉默miR-21對各組大鼠腎組織中miR-21水平影響 與Blank組比較,DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中miR-21水平明顯升高(P<0.01);與DN組比較,miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01),但Empty vector組miR-21水平無明顯變化(P>0.05);與Empty vector組比較,miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01),見表1。
表1 沉默miR-21對各組大鼠腎組織miR-21的影響
2.3沉默miR-21對各組大鼠腎功能指標(biāo)的影響 與Blank組相比,DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組SCr水平明顯升高(P<0.05),DN組和Empty vector組BUN水平明顯升高(P<0.01);與DN組相比,miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01),但Empty vector組上述指標(biāo)水平無明顯改變(P>0.05);與Empty vector組比較,miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01),見表2。
表2 沉默miR-21對各組大鼠腎功能指標(biāo)的影響
2.4沉默miR-21對各組大鼠腎組織病理變化的影響 HE染色顯示,Blank組腎組織中腎小球、間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,系膜細(xì)胞數(shù)量和基質(zhì)分布無明顯改變;DN組腎小球明顯增大,系膜細(xì)胞增殖明顯,間質(zhì)增多,腎小管上皮細(xì)胞伴有壞死、萎縮;與DN組比較,miR-21-shRNA組上述病理改變明顯減輕,但Empty vector組與DN組無明顯差異。Masson染色顯示,Blank組腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)均發(fā)生異常變化;DN組腎小球基質(zhì)中膠原纖維顯著增加,纖維組織增多;與DN組相比,miR-21-shRNA組纖維化程度減輕,但Empty vector組無明顯變化。見圖2。
圖2 沉默miR-21對各組大鼠腎組織病理變化的影響(×400) Blank組為空白對照組,DN組為糖尿病腎病組,Empty vector組為空載慢病毒組,miR-21-shRNA組為沉默miR-21組
2.5沉默miR-21對各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Blank組相比,DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01),PTEN和SMAD7表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01);與DN組相比,miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),PTEN和SMAD7表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01),但Empty vector組Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN和SMAD7表達(dá)無明顯變化(P>0.05);與Empty vector組比較,miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),PTEN和SMAD7表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),見表3。
表3 沉默miR-21對各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
miRNA是體內(nèi)高度保守、非編碼的小RNA分子,廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中,但存在差異性表達(dá)[10]。數(shù)據(jù)表明,miRNA在DN中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。本研究采用qRT-PCR檢測DN患者和體檢健康者血清中miR-21的表達(dá),結(jié)果顯示miR-21在DN患者中的表達(dá)明顯高于體檢健康者,提示miR-21可能參與DN的發(fā)病過程,與McClelland等[12]研究結(jié)果一致。但miR-21在DN中的具體作用機制還需進(jìn)一步研究。
近年來,miR-21調(diào)控作用研究已在各領(lǐng)域中展開。腫瘤方面研究發(fā)現(xiàn),miR-21是一種潛在的促癌基因,與腎癌、胃癌、肺癌等多種癌癥密切相關(guān),且相關(guān)機制研究較多[13]。心血管系統(tǒng)方面研究發(fā)現(xiàn),miR-21可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。Wang等[15]研究顯示,miR-21在DN中過表達(dá),可介導(dǎo)TGF-β1加劇腎損傷。本研究通過高糖高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)DN大鼠模型,驗證了miR-21在DN中的作用。同時,抑制miR-21的表達(dá)可顯著改善DN大鼠腎組織病理損傷,降低血清SCr、BUN水平,進(jìn)一步說明miR-21可能參與了DN的發(fā)展過程。
Bao等[16]研究顯示,miR-21通過作用于下游靶基因,來減少細(xì)胞外基質(zhì)降解、促進(jìn)腎臟間質(zhì)肥大和系膜基質(zhì)沉積,加劇腎臟組織纖維化,但國內(nèi)尚缺乏相關(guān)報道。PTEN基因是蛋白激酶(AKT)的負(fù)性調(diào)節(jié)器,通過將磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸的第3位脫磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?,5-二磷酸磷脂酰肌醇,從而抑制AKT活性,阻斷PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路,而參與多種生命活動過程。Sekar等[17]觀察到OVE26 Ⅰ型糖尿病小鼠的系膜細(xì)胞中miR-21異常高表達(dá),隨著病程的遷延,其腎臟組織中miR-21表達(dá)也逐漸升高;同時,高表達(dá)的miR-21會抑制PTEN的表達(dá),敲低miR-21表達(dá)后PTEN表達(dá)增加,說明高血糖可引起腎臟組織中miR-21表達(dá)的增加,抑制 PTEN 蛋白表達(dá)可加劇腎纖維化。另外,細(xì)胞外基質(zhì)沉積也是DN重要的病理表現(xiàn)之一。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-21可能經(jīng)介導(dǎo)SMAD7調(diào)節(jié)腎損傷,敲除miR-21恢復(fù)腎組織中SMAD7水平,并抑制TGF-β1和核轉(zhuǎn)錄因子活化,從而改善腎纖維化程度。本研究顯示,DN大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的纖維化,且Col I、MMP-2及TGF-β1的表達(dá)明顯上調(diào),PTEN和SMAD7的表達(dá)明顯下調(diào);而沉默miR-21后,腎纖維化程度降低,Col I、MMP-2及TGF-β1的表達(dá)顯著下調(diào),PTEN和SMAD7的表達(dá)明顯上調(diào),提示miR-21可能通過抑制PTEN/SMAD7信號傳導(dǎo)通路,上調(diào)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,引起DN大鼠腎纖維化,與上述研究結(jié)果相符。
綜上所述,干擾miR-21的表達(dá)可作為治療DN的潛在策略,其可能通過PTEN/SMAD7信號傳導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)腎組織纖維化,但DN不同階段與miR-21的關(guān)系還需大量臨床研究驗證。