張衛(wèi)華，陳 東

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)作為糖尿病引起的一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，會出現(xiàn)不同程度的骨密度降低[1-2]。相關(guān)研究結(jié)果表明，1型糖尿病患者骨折的發(fā)生率是非糖尿病人群的6.3～6.9倍[3]，而骨折后的致殘率及病死率極高，極大影響患者生活質(zhì)量。葉黃素作為一種有效的抗氧化劑，能夠有效緩解游離自由基對人體細(xì)胞及器官的過氧化損傷，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)視覺、預(yù)防動脈硬化、抗氧化、抗癌等作用[4]。相關(guān)研究顯示氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)在DOP發(fā)生進(jìn)展中扮演著重要角色[5-6]。故本研究旨在通過建立糖尿病并卵巢切除骨質(zhì)疏松模型，后用葉黃素進(jìn)行干預(yù)，分析其對DOP的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雌性8周齡SD大鼠30只，體質(zhì)量250～280 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK(粵)2019-0035]，常規(guī)飼養(yǎng)、全天自由飲水，培育室溫度20～25℃，濕度65%～70%，進(jìn)行人工光照(晝夜各12 h)。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自Solarbio公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；兔抗大鼠核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自上海谷研實業(yè)有限公司。

1.3實驗動物分組及模型制備 30只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組各10只。模型組及干預(yù)組大鼠進(jìn)行糖尿病造模前12 h禁食不禁飲，采取腹腔單次注射STZ 60 mg/kg，假手術(shù)組給予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射，注射后正常飲水飲食。注射72 h后檢測大鼠空腹血糖，>16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功。將造模成功后的模型組及干預(yù)組大鼠用10%水合氯醛麻醉后，保持仰臥位固定在手術(shù)臺上，于腹部正中線切3 cm長的縱向切口，使皮膚切口偏向另一側(cè)后，分離髂棘上1.5 cm處的肌肉，以眼科彎鉗深入切口，找到一側(cè)卵巢，用手術(shù)線結(jié)扎輸卵管后切除并止血，采取同樣方式切除另一側(cè)卵巢，完成后間斷縫合肌肉及皮膚，并在切口處滴青霉素抗炎。假手術(shù)組大鼠同樣方式找到卵巢，切除卵巢附近小塊脂肪，其余步驟一致。以股骨骨密度及血清雌二醇降低視為DOP造模成功[7]。

1.4藥物干預(yù) 手術(shù)完成后1周，干預(yù)組大鼠給予200 mg/kg葉黃素灌胃干預(yù)，每日1次，假手術(shù)組及模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉注射液每日1次灌胃。藥物干預(yù)8周。

1.5樣本采集 末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定在XR-36雙能X線骨密度測量儀(亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所生產(chǎn))上，檢測后肢股骨密度，取下腔靜脈血1500 r/min離心15 min后，取上清存于-20℃條件下待測。斷頭處死大鼠，分離右側(cè)股骨，一部分以10%甲醛固定并加入10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣后用于組織切片觀察，另一部分于液氮中速凍轉(zhuǎn)存至-80℃待測。

1.6股骨組織HE染色 取“1.5”中固定、脫鈣后的股骨組織進(jìn)行常規(guī)脫水、透蠟、包埋、切片后，蘇木素伊紅染色，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察染色情況并拍照。利用BI 2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞計數(shù)。

1.7血清鈣水平及炎癥因子檢測 取“1.5”中制備好的血清，采用全自動生化分析儀測定血清鈣水平。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定樣本在450 nm處的吸光度(OD)值，并以固定濃度標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)檢測樣品測得的OD值計算相應(yīng)的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8股骨組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取“1.5”中分離的股骨在液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，稱取50 mg樣本加入450 μl磷酸緩沖鹽溶液后混勻，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作步驟測定SOD、MDA、ROS水平，計算方式同“1.7”。

1.9Western blot法檢測股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1水平 取“1.5”中分離的股骨在液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，稱取50 mg樣本加入450 μl磷酸緩沖鹽溶液后混勻，經(jīng)高速低溫離心去沉淀，進(jìn)行BCA蛋白定量、高溫蛋白變性，通過Bradford法調(diào)整各組蛋白濃度一致。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗大鼠Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH抗體(1︰1000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1︰500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分OD比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1葉黃素對各組大鼠病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組股骨組織中可見骨小梁排列整齊，間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，未見破骨細(xì)胞；模型組骨小梁排列紊亂，可見大量間充質(zhì)細(xì)胞和紅細(xì)胞，并且破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加，成骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少；干預(yù)組有新生骨小梁形成，破骨數(shù)量顯著減少，成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多。見圖1。

與假手術(shù)組相比，模型組骨密度、血清鈣、成骨細(xì)胞數(shù)降低，而破骨細(xì)胞數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組與假手術(shù)組相比，骨密度、血清鈣降低，破骨細(xì)胞數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組骨密度、血清鈣、成骨細(xì)胞數(shù)升高，而破骨細(xì)胞數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同方法處理的SD大鼠骨密度、血清鈣水平及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞計數(shù)比較

2.2葉黃素對各組大鼠股骨組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組和干預(yù)組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強(qiáng)度升高，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強(qiáng)度降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同方法處理的SD大鼠股骨組織SOD、MDA、ROS水平比較

2.3葉黃素對各組大鼠血清炎癥因子水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組和干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同方法處理的SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6比較

2.4葉黃素對各組大鼠股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組和干預(yù)組股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖2及表4。

表4 不同方法處理的SD大鼠股骨組織Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)

3 討論

隨著人民生活水平的提高及老齡化程度的加重，糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為腫瘤及心腦血管疾病后的第三大慢性非傳染性疾病[8]。STZ是誘發(fā)糖尿病模型的常用藥劑，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg 21 d后可顯著觀察到骨骺端堿性磷酸酶活性及鈣離子含量降低[9]。本研究通過STZ注射和卵巢切除誘導(dǎo)DOP模型，結(jié)果顯示大鼠骨密度、血清鈣、成骨細(xì)胞數(shù)顯著降低，而破骨細(xì)胞數(shù)顯著升高，表明造模成功。

研究表明，氧化應(yīng)激是DOP重要發(fā)病機(jī)制之一。正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生及清除會處于一種動態(tài)平衡，故破骨細(xì)胞產(chǎn)生的適量自由基能發(fā)揮促進(jìn)骨組織改建作用[10]。胰島素缺乏后會抑制抗氧化酶活性，清除ROS能力降低，破骨細(xì)胞產(chǎn)生的自由基產(chǎn)物無法清除，過量的氧自由基會產(chǎn)生一系列氧化損傷，抑制大部分細(xì)胞的分化、生長及增殖過程[11]。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨組織中SOD活性顯著降低，MDA含量及ROS熒光強(qiáng)度顯著升高；與模型組相比，干預(yù)組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強(qiáng)度降低，SOD活性升高。表明DOP大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)較為嚴(yán)重，而葉黃素干預(yù)后，SOD活性顯著升高，MDA及ROS顯著降低，可能是因葉黃素本身就是一種有效的自由基清除劑，能通過與ROS作用，降低ROS水平，減輕其對SOD活性的抑制作用，同時減少過量ROS對脂膜的攻擊，從而降低MDA。Nrf2是一種重要的抗氧化蛋白，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，Nrf2能迅速磷酸化激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，通過作用下游ARE蛋白，促進(jìn)HO-1、SOD、NQO1等的表達(dá)[12]。HO-1作為Nrf2的下游靶蛋白具有多種作用，高表達(dá)HO-1可以顯著減輕組織損傷[13]；NQO1則是一類黃素蛋白酶，通過催化胞內(nèi)雙電子還原反應(yīng)，進(jìn)而解除醌類物質(zhì)對細(xì)胞的毒害，從而發(fā)揮細(xì)胞和器官保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平均顯著降低，葉黃素干預(yù)后Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平均顯著升高，表明葉黃素可能是通過激活Nrf2信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)抗氧化蛋白表達(dá)，從而改善DOP大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)骨組織。

炎性反應(yīng)也是DOP的重要發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的同時會促進(jìn)TNF-α、IL-1β等促炎因子合成，同時也會激活NF-κB信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)骨形成蛋白及IL-6等促炎因子表達(dá)，并利于破骨細(xì)胞增殖、分化及生長，加速骨吸收，促進(jìn)DOP進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著升高，而葉黃素干預(yù)后TNF-α、IL-1β、IL-6均下降，可能原因為葉黃素改善了DOP大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)程度，降低自由基水平，減少了對炎性反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路的刺激。

綜上，葉黃素可能通過激活Nrf2信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)抗氧化酶合成分泌，減輕DOP大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性反應(yīng)程度，從而緩解骨質(zhì)疏松。