潘 亮，田守森，田雯艷

創(chuàng)傷性腦出血(traumatic intracerebral hemorrhage， TICH)引起的缺氧腦水腫會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷腦神經(jīng)元并引起神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能的損傷[1]。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)中藥在治療TICH腦出血以及保護(hù)神經(jīng)功能中有巨大作用，銀杏達(dá)莫的主要成分為銀杏黃酮苷、萜類(lèi)內(nèi)酯及雙嘧達(dá)莫等，作為一種復(fù)方制劑，具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗炎作用，并且研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銀杏達(dá)莫在治療TICH中的作用[2]。此外，銀杏達(dá)莫也具有促進(jìn)TICH患者神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[3]，但是其機(jī)制尚不清楚。臨床研究已經(jīng)顯示了針灸可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激保護(hù)腦神經(jīng)功能，但是其具體的作用機(jī)制尚不清楚[4-5]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2)通路是機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要通路，其可通過(guò)促進(jìn)下游血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1， HO-1)發(fā)揮抗氧化作用，已經(jīng)有研究顯示上調(diào)Nrf2/HO-1通路可有效緩解腦出血引起的神經(jīng)損傷[6]。本研究建立了TICH大鼠模型，通過(guò)銀杏達(dá)莫和針灸共同干預(yù)7 d，發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1通路減少腦神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)功能?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(清潔級(jí)，240～280 g，南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；AU640全自動(dòng)生化分析儀(Olympus公司，日本)；銀杏達(dá)莫注射液(貴州益佰制藥，H52020031)；28號(hào)1寸毫針(環(huán)球針灸醫(yī)療器械，中國(guó))；TUNEL凋亡試劑盒(碧云天公司，中國(guó))；Nrf2和HO-1抗體和相關(guān)二抗(Abcam公司，美國(guó))；PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器 NM-G1型小動(dòng)物核磁共振成像儀(紐邁科技公司，中國(guó))；水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(泰盟科技有限公司，中國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus IX71，Tokyo，日本)；ABI 7500 PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Life technology公司，美國(guó))。

1.3分組、建模和干預(yù)方法 選擇10只大鼠作為對(duì)照組，然后選擇45只大鼠通過(guò)擊打的方法建立TICH模型。首先通過(guò)腹腔注射戊巴比妥(劑量為2 ml/kg，濃度為20 g/L)麻醉大鼠，然后根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]通過(guò)擊打建立TICH模型。大鼠俯臥固定在手術(shù)臺(tái)，在額頂剃毛、消毒，人字縫和矢狀縫右側(cè)3 mm做2 cm的切口后鉆直徑為5 mm孔，在鉆孔的過(guò)程中注意保持硬膜完整。然后將致傷墊片放置在孔上，以20 g砝碼放在距頭頂30 cm的高度行自由落體擊打顱骨制備TICH模型。對(duì)照組大鼠僅鉆孔。將建模成功大鼠隨機(jī)分為T(mén)ICH組、銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組。在建模后24 h，銀杏達(dá)莫組大鼠腹腔注射銀杏達(dá)莫0.4 ml/kg，注射時(shí)間10 min，每日1次，連續(xù)注射5 d。對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水。銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組大鼠在銀杏達(dá)莫組基礎(chǔ)上進(jìn)行針灸干預(yù)，根據(jù)參考文獻(xiàn)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》[8]找出百會(huì)穴和曲鬢穴，使用毫針透刺0.8寸，然后快速捻轉(zhuǎn)(每分鐘200轉(zhuǎn))，每次捻轉(zhuǎn)5 min，停針30 min，每日1次，連續(xù)5 d，剔除期間死亡大鼠。

1.4建模結(jié)果評(píng)估 在建模后通過(guò)NM-G1型小動(dòng)物核磁共振成像儀分析腦出血情況。然后在大鼠清醒后根據(jù)Longa評(píng)分[9]法對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，總分0～4分，分?jǐn)?shù)越高提示缺損越嚴(yán)重。核磁共振成像發(fā)現(xiàn)明顯出血并且Longa評(píng)分>2分的大鼠為T(mén)ICH建模成功。

1.5水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)功能 在干預(yù)后(建模后第6天)使用水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)分析大鼠神經(jīng)功能，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，通過(guò)檢測(cè)大鼠的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能，其中逃避潛伏期越長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6TUNEL染色檢測(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將腦出血周?chē)X組織固定并透化，然后將其放置于TUNEL溶液中，在37℃下孵育1 h。洗滌后加入Converter-POD溶液孵育30 min。之后依次進(jìn)行顯色、DAPI染色，然后進(jìn)行封片。通過(guò)檢測(cè)熒光反應(yīng)計(jì)算凋亡率。

1.7RT-qPCR檢測(cè)Nrf2和HO-1 mRNA水平 使用Trizol獲得腦組織中總RNA并檢測(cè)其濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA用于合成cDNA(42℃下60 min，70℃下5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(在95℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)，94℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 1 min，4℃保存)。比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達(dá)。GAPDH用于標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8Western Blotting檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白水平 在液氮的保護(hù)下裂解腦組織，在12 000 r/min，4℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白濃度。SDS-PAGE(10%)電泳后進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)、封閉。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過(guò)夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1建模后腦出血情況 核磁共振檢查結(jié)果顯示，建模后TICH組、銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組大鼠腦組織出現(xiàn)出血情況，提示擊打的方法建立TICH模型成功。見(jiàn)圖1。

圖1 4組大鼠建模后腦出血情況TICH為創(chuàng)傷性腦出血

2.2神經(jīng)缺損情況 大鼠清醒后行Longa評(píng)分結(jié)果顯示4只建模失敗，41只建模成功。然后隨機(jī)選擇39只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為T(mén)ICH組、銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組，每組13只。隨機(jī)選擇10只檢測(cè)Longa評(píng)分，結(jié)果顯示3組Longa評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后TICH組大鼠1只死亡。干預(yù)后每組大鼠隨機(jī)選擇10只進(jìn)行后續(xù)研究，結(jié)果顯示銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組Longa評(píng)分顯著低于TICH組，并且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組低于銀杏達(dá)莫組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組TICH大鼠Longa評(píng)分比較分)

2.3水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較，TICH組的逃避潛伏期顯著升高，而穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低(P<0.05)。銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組的逃避潛伏期顯著低于TICH組，而穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組的逃避潛伏期顯著低于銀杏達(dá)莫組，而穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于銀杏達(dá)莫組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)

2.4腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 對(duì)照組、TICH組、銀杏達(dá)莫組、銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為(5.14±0.79)%、(36.54±4.97)%、(20.83±4.72)%、(12.48±1.45)%。與對(duì)照組比較，TICH組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組低于銀杏達(dá)莫組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 4組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(比例尺為50 μm)TICH為創(chuàng)傷性腦出血

2.5腦組織Nrf2和HO-1水平 與對(duì)照組比較，TICH組腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組的Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)顯著高于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組高于銀杏達(dá)莫組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠腦組織Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

TICH是腦出血的一種，具有較高的致殘率和病死率，雖然近年來(lái)關(guān)于治療TICH的新方法和護(hù)理策略被應(yīng)用于臨床，TICH患者的神經(jīng)功能損傷是影響預(yù)后和生活質(zhì)量的重要因素。臨床研究顯示，急性腦出血患者神經(jīng)功能的損傷可能與預(yù)后較差有關(guān)[10]，并且神經(jīng)功能的變化可能直接影響預(yù)后[11]。因此對(duì)于TICH的臨床治療，除及時(shí)控制腦出血、清除腦血腫和腦水腫外，還應(yīng)減輕患者的腦損傷。近年來(lái)多種干預(yù)方式被應(yīng)用于腦出血后的神經(jīng)功能恢復(fù)，包括亞低溫、高壓氧、腦保護(hù)藥物等，但是其作用較有限，中醫(yī)中藥在治療腦出血神經(jīng)功能受損中表現(xiàn)出了較好的效果，本研究分析銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸治療對(duì)TICH神經(jīng)功能的保護(hù)作用。

銀杏達(dá)莫是第四代銀杏葉提取物，分析學(xué)研究顯示其主要活性成分包括銀杏內(nèi)酯、銀杏總黃酮、雙嘧達(dá)莫等，在治療腦出血、心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中均具有較好的效果[3,12]。銀杏達(dá)莫在神經(jīng)保護(hù)中的作用在臨床上被廣泛發(fā)現(xiàn)，一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)銀杏提取物對(duì)癡呆具有一定的治療效果[13]。Mohamed和Abd El-Moneim[14]研究認(rèn)為，銀杏葉提取物可對(duì)氯化鋁引起的大腦退行性改變有保護(hù)作用，并且這種作用可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和神經(jīng)遞質(zhì)水平實(shí)現(xiàn)。針灸是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，其可通過(guò)促進(jìn)血液微循環(huán)、血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)電生理等改善神經(jīng)功能，并發(fā)揮改善神經(jīng)痛、提高神經(jīng)功能的作用[15-16]。本研究通過(guò)擊打的方法建立TICH大鼠模型，并通過(guò)核磁共振驗(yàn)證了建模結(jié)果，然后分別通過(guò)銀杏達(dá)莫和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸干預(yù)，結(jié)果顯示，建模后TICH組、銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組Longa評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干預(yù)后銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組Longa評(píng)分低于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組低于銀杏達(dá)莫組。此外，TUNEL實(shí)驗(yàn)也顯示，與對(duì)照組比較，TICH組的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高，銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組低于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組低于銀杏達(dá)莫組。腦出血后會(huì)導(dǎo)致出血附近腦組織出現(xiàn)腦血腫和腦水腫，此部分區(qū)域的腦組織供血不足，而缺氧會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)并引起神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能的下降，而銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸可能通過(guò)恢復(fù)病灶腦組織的供血和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用。

為進(jìn)一步分析銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸保護(hù)TICH神經(jīng)功能的機(jī)制，我們檢測(cè)了腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白的水平。Nrf2蛋白可促進(jìn)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element， ARE)的激活并促進(jìn)HO-1的釋放，從而發(fā)揮抗氧化作用[17]。在發(fā)生腦缺血/再灌注或腦出血初期，腦組織中的Nrf2通路會(huì)激活并發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)腦神經(jīng)，但是隨著時(shí)間的推移Nrf2通路的激活逐漸降低，HO-1的水平也下調(diào)，研究認(rèn)為促進(jìn)Nrf2/HO-1可能是治療腦出血的新靶點(diǎn)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后TICH組的大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白的水平顯著高于對(duì)照組，銀杏達(dá)莫組和銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組高于TICH組，且銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸組高于銀杏達(dá)莫組。臨床研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Nrf2/ARE在急性腦創(chuàng)傷中的保護(hù)作用，并且促進(jìn)Nrf2通路可通過(guò)改善腦組織氧化應(yīng)激水平保護(hù)腦神經(jīng)功能[20-21]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)了銀杏內(nèi)酯可保護(hù)氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，并提高細(xì)胞活力，可作為腦缺血/再灌注的神經(jīng)保護(hù)劑[22]。而氧化應(yīng)激反應(yīng)可直接或者通過(guò)炎性因子直接或間接引起細(xì)胞損傷和凋亡，從而保護(hù)腦神經(jīng)功能[23]。此外，Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK和NF-κB/IκBα通路調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。針灸具有調(diào)節(jié)局部微循環(huán)的作用，并且具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的功能，從而改善癲癇模型小鼠的神經(jīng)功能[25]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)針灸可通過(guò)促進(jìn)Nrf2-ARE信號(hào)通路改善帕金森小鼠模型的神經(jīng)功能[26]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)銀杏達(dá)莫可通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1通路改善氧化應(yīng)激水平，而針灸也可通過(guò)促進(jìn)微循環(huán)改善腦組織供氧，并進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2/HO-1通路，銀杏達(dá)莫和針灸協(xié)同調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激并減少腦神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)TICH后腦神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，銀杏達(dá)莫可與針灸協(xié)同作用，促進(jìn)腦組織中Nrf2/HO-1通路的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)TICH大鼠的神經(jīng)功能。但是關(guān)于銀杏達(dá)莫中活性物質(zhì)對(duì)Nrf2/HO-1通路的影響還需要進(jìn)一步研究。