尹華慶，王建田，劉 敏

（1. 隆回縣橫板橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，湖南 邵陽 422200；2. 隆回縣七江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，湖南 邵陽 422205；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

油茶是我國特有的木本油料作物，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油樹種。而油茶產(chǎn)業(yè)也是湖南省非常重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)[1]。我國油茶常見病害約有20 種，其中以炭疽病、煤污病和軟腐病的發(fā)生較普遍且嚴重[2-3]。油茶炭疽病主要引起油茶葉片枯死及花果早落，嚴重時可使油茶減產(chǎn)率超過50%，其病原菌主要為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[4]。筆者從田間發(fā)病的油茶葉片上進行病原菌的分離與鑒定，并開展殺菌劑對油茶炭疽病致病菌的室內(nèi)毒力測定，以期為油茶炭疽病的田間防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：油茶炭疽病病葉于2019 年采集自湖南省邵陽市隆回縣橫板橋鎮(zhèn)油茶種植基地，用樣品袋裝好帶回實驗室備用。油茶炭疽病菌的培養(yǎng)及室內(nèi)藥劑篩選在PDA 培養(yǎng)基上進行。

供試藥劑：80%戊唑醇可濕性粉劑（淄博新農(nóng)基作物科學有限公司）；40%腈菌唑可濕性粉劑（山西運城綠康實業(yè)有限公司）；6%春雷霉素可濕性粉劑（陜西省臨猗中晉化工有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊農(nóng)藥中試廠）；50%甲基硫菌靈可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；30%肟菌·戊唑醇懸浮劑（拜耳作物科學有限公司）；43%氟菌·肟菌酯懸浮劑（拜耳作物科學有限公司）；400 g/L 氟硅唑乳油（江門市大光明農(nóng)化新會有限公司）；75%百菌清可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；50%多菌靈可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）。

基因組DNA 提取試劑盒、PCR 擴增試劑盒、真菌ITS 通用引物ITS1/ITS4，均購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶炭疽病病原菌分離及致病性測定 采用組織分離法從感染油茶炭疽病的油茶葉片病健交界處分離病原真菌，分離得到的真菌回接至健康油茶葉片，能夠產(chǎn)生相同病斑的即為油茶炭疽病病原真菌。從接種后發(fā)病的油茶葉片再次分離病原菌，并與原來分離的病原菌比較，以驗證該病菌是否符合柯赫氏法則。將純化好的病原菌株命名為YCTJ，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 病原菌鑒定 （1）形態(tài)學鑒定。將病原菌YCTJ 在PDA 平板上進行活化培養(yǎng)，用打孔器（直徑6 mm）從活化好的菌落邊緣打孔移取菌餅，轉(zhuǎn)移至新的PDA 平板，設(shè)置5 個重復，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察病原菌分生孢子的形態(tài)。（2）分子生物學鑒定。采用試劑盒提取病原菌YCTJ 的基因組DNA，電泳檢測提取DNA 質(zhì)量后，采用真菌ITS 序列通用擴增引物ITS1/ITS4（5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌基因組DNA 的ITS 序列進行擴增，擴增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將ITS 測序結(jié)果在NCBI 中進行BLAST 比對，根據(jù)比對結(jié)果選取代表性序列，采用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建進化樹，結(jié)合形態(tài)學特征和系統(tǒng)進化樹對油茶炭疽病病原進行鑒定。

1.2.3 室內(nèi)藥劑篩選試驗 用約70℃的無菌PDA 培養(yǎng)基將各藥劑分別按推薦劑量稀釋，制成含殺菌劑的混藥平板備用。采用生長速率法測定不同藥劑對油茶炭疽病病原菌生長的影響。在含殺菌劑的PDA 培養(yǎng)基中接入活化好的供試菌株菌餅（d=6 mm），置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，7 d 后待空白對照菌落長滿平板時用“十字交叉法”測量菌落直徑，每種藥劑設(shè)3 個重復，以無菌水作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶炭疽病病原菌的分離鑒定

2.1.1 致病菌分離 采用組織分離法得到Y(jié)CTJ，將分離得到的真菌采用刺傷接種法回接至健康油茶葉片上，產(chǎn)生的病斑和田間病斑基本一致（圖1），從接種后發(fā)病的油茶葉片分離的病原菌與原來接種的病原菌保持一致。這表明分離的真菌符合柯赫氏法則，即所得真菌是油茶炭疽病的病原菌。

2.1.2 形態(tài)學鑒定 油茶炭疽病病原菌YCTJ 在PDA平板上的菌落形態(tài)如圖2 所示。從圖2 可以看出，YCTJ 菌株菌落在PDA 平板上為圓形，邊緣整齊，菌絲為白色，較為茂密，后期轉(zhuǎn)為灰色或淺褐色，菌落背面為灰褐色；分生孢子呈長橢圓形，單孢，無色，兩端鈍圓或一頭稍尖，兩端可見油球。通過形態(tài)學特征分析將YCHJ 初步鑒定為膠孢炭疽菌。

2.1.3 分子生物學鑒定 采用試劑盒提取油茶炭疽病菌全基因組DNA，利用真菌ITS 擴增通用引物進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序得到全長為1 416 bp 的片段，將油茶炭疽病病原菌YCTJ 菌株的ITS 序列登錄到NCBI 中進行比對，發(fā)現(xiàn)YCTJ 菌株與登錄號為AJ301908.1 的菌株同源性為98%。構(gòu)建了基于ITS 序列的油茶炭疽病菌進化樹，如圖3 所示，YCTJ 與膠孢炭疽菌處于同一分支。結(jié)合YCTJ 菌株的菌落形態(tài)，將YCTJ 菌株最終鑒定為膠孢炭疽菌。

2.2 不同殺菌劑對油茶炭疽病菌的抑制效果

由表1 可知，400 g/L 氟硅唑乳油、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑、80%戊唑醇可濕性粉劑、30%肟菌·戊唑醇懸浮劑和43%氟菌·肟菌酯懸浮劑這5 種殺菌劑對油茶炭疽病菌的抑制明顯，菌絲生長抑制率在98.41%～100%之間，可以作為油茶炭疽病田間防治的備選藥劑。

圖1 采集的油茶病葉（左）及病原菌接種后病斑形態(tài)（右）

圖2 油茶炭疽病病原菌YCTJ 的菌落及分生孢子形態(tài)

圖3 基于ITS 序列的油茶炭疽病菌進化樹

表1 10 種殺菌劑對油茶炭疽病菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

采用組織分離法分離得到了油茶炭疽病病原菌YCTJ，通過柯赫氏法則驗證、形態(tài)學和分子生物學鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，證實其病原菌為膠孢炭疽菌。目前關(guān)于油茶炭疽病菌病原菌鑒定的報道較多，筆者的研究結(jié)果與朱英芝等[5]、葉航等[6]的報道一致。而除了膠孢炭疽菌，能引起油茶炭疽病的病原還有博寧炭疽菌（Colletotrichum boninense）[7]、卡哈瓦炭疽菌（Colletotrichum kahawae）等[8]。在油茶炭疽病的鑒定中，一般采用形態(tài)學特征結(jié)合分子生物學鑒定的手段進行，在該研究中，僅對油茶炭疽病菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進行了擴增和測序。而通常為了保證鑒定的準確性，一般要采用多基因系統(tǒng)學分析方法鑒定。如李河等[9]同時對油茶炭疽病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）鈣調(diào)蛋白（CAL）3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）進行了分子生物學分析。這樣的鑒定準確性更高。

筆者還測定了10 種殺菌劑對油茶炭疽病菌的室內(nèi)抑制效果。結(jié)果顯示，400 g/L 氟硅唑乳油、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑、80%戊唑醇可濕性粉劑、30%肟菌·戊唑醇懸浮劑、43%氟菌· 肟菌酯懸浮劑這5 種殺 菌劑對油茶炭疽病菌的生長抑制效果均達到98%以上， 室內(nèi)防效顯著，可以作為田間防治的備選藥劑。油茶炭疽病室內(nèi)藥劑篩選的報道較少，僅有陳紹紅等[10]、曹志華等[11]開展了少量研究，而這幾種藥劑的室內(nèi)毒力測定結(jié)果只是為田間防治提供了參考，這些藥劑對油茶炭疽病的田間防效有待進一步驗證。