李蘋，譚松，姚忠祎，傅金鐘，陳競峰

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.圭爾夫大學(xué)，圭爾夫ON N1G 2W1，加拿大)

海塞規(guī)則(Hesse’s rule)認(rèn)為，在寒冷環(huán)境下，動物的能量代謝需求會增加，心臟與體質(zhì)量之比會大于生活在溫暖環(huán)境中的同種(或近緣種)動物，這一規(guī)則也被稱為心臟-體質(zhì)量規(guī)則(Hesse，1937；Hammondetal.，1999；Mulleretal.，2014；Cardilinietal.，2016)。此規(guī)則的生理學(xué)基礎(chǔ)是增加心臟的相對大小能提高每博輸出量和毛細(xì)血管中的循環(huán)血量，從而保證在低溫等環(huán)境條件下為身體各器官提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，同時把CO2、乳酸和其他代謝產(chǎn)物及時有效地排出體外(Mulleretal.，2014；Shirkey &Hammond，2014)。除了心臟，與代謝關(guān)系密切的其他內(nèi)臟器官(肺、肝、腎)的相對大小也可能受環(huán)境溫度影響，但這些內(nèi)臟器官的變化模式與心臟的變化模式的相似程度，取決于它們與心臟功能的關(guān)聯(lián)程度(Nespoloetal.，2002；Canale &Henry，2010)。

海塞規(guī)則的實(shí)驗(yàn)例證主要來自于內(nèi)溫動物。外溫動物與內(nèi)溫動物在代謝生理上差異巨大(Gilloolyetal.，2017)。因此我們預(yù)期，內(nèi)溫動物與外溫動物在心臟形態(tài)適應(yīng)高海拔環(huán)境方面可能存在差異。低溫和低氧是高海拔環(huán)境下最重要的環(huán)境脅迫因素。一般認(rèn)為，高海拔環(huán)境條件下，低氧將抑制外溫動物的代謝強(qiáng)度，潛在地降低心臟大小(Boutilieretal.，1997；Trzcionkaetal.，2008；Lietal.，2016；Storey &Storey，2017)，而低溫將增加心臟大小及肌肉中紅肌的比例(Young &Egginton，2011)。因此，外溫動物心臟大小對高海拔的適應(yīng)是應(yīng)對低溫和低氧雙重脅迫后的綜合表現(xiàn)，但已有的研究結(jié)果存在明顯分歧(Zhongetal.，2017；Zhaoetal.，2019)，這些分歧可能部分源于表型方差的解析程度。外溫動物的心臟大小不但受遺傳因素影響，也受環(huán)境因素制約，分離遺傳和環(huán)境效應(yīng)的常用方法是同園實(shí)驗(yàn)(common garden experiment)。同園實(shí)驗(yàn)中，相似的環(huán)境條件剔除了環(huán)境方差，不同物種或種群的組間方差很大程度上可歸因于遺傳效應(yīng)；若利用人工繁殖的子代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則克服了母體效應(yīng)、發(fā)育可塑性等干擾，若僅采用野外馴化個體開展實(shí)驗(yàn)，組間方差中則包括了遺傳和發(fā)育可塑性水平的差異(Berven，1982；Martinetal.，2004)。

中華蟾蜍Bufogargarizans屬廣布種，在我國除新疆、臺灣、海南均有分布(Zhan &Fu，2011；Wenetal.，2015)。分布范圍跨越了極大的海拔梯度(750～3 500 m)，是研究外溫動物適應(yīng)高海拔環(huán)境的理想動物類群(Liaoetal.，2015；Guoetal.，2016；Yangetal.，2017)。野外研究發(fā)現(xiàn)，海拔對川西橫斷山區(qū)中華蟾蜍的心臟大小沒有顯著影響(Zhaoetal.，2019)，但該研究未區(qū)分表型可塑性與遺傳及發(fā)育可塑性的效應(yīng)。本研究采用同園實(shí)驗(yàn)比較不同海拔中華蟾蜍心、肺、肝等內(nèi)臟器官的相對大小，其中，假設(shè)在同園環(huán)境中，與棲居于低海拔地區(qū)的種群相比，生活在高海拔地區(qū)的中華蟾蜍種群應(yīng)該具有相對較小的心臟，即反海塞規(guī)則。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

2018—2019年，在四川省西部山區(qū)的7個采樣點(diǎn)捕獲128只成年中華蟾蜍個體(圖1，表1)。1～4 號采樣點(diǎn)屬岷江水系，為Ⅰ號樣線；5～7號采樣點(diǎn)屬大渡河水系，為Ⅱ號樣線。7個采樣點(diǎn)分為：低海拔(<1 000 m)、中海拔(1 600～2 100 m)和高海拔(>2 600 m)。動物捕獲后運(yùn)送至中國科學(xué)院成都生物研究所動物房飼養(yǎng)。動物房內(nèi)溫度控制在20 ℃±1 ℃，光周期設(shè)定為12 h∶12 h(08∶00開，20∶00關(guān))。中華蟾蜍單只飼養(yǎng)于長35.5 cm×寬25 cm×高15 cm的塑料盒內(nèi)，盒內(nèi)放置一塊濕海綿(5 cm×7 cm)用于保持濕度、一塊U形瓦片(長15 cm×寬14 cm×高7 cm)作為庇護(hù)所。以沾有鈣粉(Exo Terra)的黃粉蟲Tenebriomolitor喂食，每2 d喂食1次，同時清潔飼養(yǎng)盒。每周補(bǔ)喂蟋蟀1次。所有中華蟾蜍均在盒內(nèi)馴化至少3個月以上(表1)。

圖1 中華蟾蜍取樣位點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of Bufo gargarizans

表1 中華蟾蜍的7個采樣點(diǎn)信息Table 1 Geographical information of 7 sampling sites of Bufo gargarizans

1.2 解剖取樣

中華蟾蜍處死前用電子天平稱量體質(zhì)量(±0.01 g)，游標(biāo)卡尺測量體長(±0.01 cm)。然后用MS-222溶液(0.2%，M/V)進(jìn)行深度麻醉，直至其對外界刺激(用鑷子夾后腿肌肉)無反應(yīng)為止。處死中華蟾蜍后，分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和脂肪體各器官，并剔除器官表面附著的結(jié)締組織，用濾紙吸干器官表面的水分后包裹于錫箔紙內(nèi)。最后將樣品置于恒溫干燥箱(GZX-450ASB型)內(nèi)65 ℃烘48 h。各臟器的絕對干重根據(jù)烘烤前后的質(zhì)量變化計算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先采用Minitab 16.1.0對所有的反應(yīng)變量進(jìn)行Johnson轉(zhuǎn)換使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，然后用SPSS 20.0對轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型分析。使用一般線性模型(general linear model)比較各個內(nèi)臟器官質(zhì)量在海拔間的差異。在模型中，將樣線、海拔、性別作為固定因素，馴化時間(不同海拔的馴化時間不同)、體長(snout-vent length，SVL)作為協(xié)變量，同時把固定因素的交互作用納入模型中，當(dāng)交互效應(yīng)不顯著時(P>0.05)，則從模型中剔除以降低模型的復(fù)雜性。各臟器的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

除脾臟外，海拔對各內(nèi)臟器官(心臟、肝臟、肺臟、腎臟和脂肪體)質(zhì)量的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)：低海拔心臟、肝臟、腎臟的干重均大于中、高海拔，中、高海拔間沒有差異；與低海拔相比，中、高海拔的肺臟質(zhì)量有降低趨勢，但只有中海拔達(dá)到顯著水平(表2，表3)。另外，脂肪體干重海拔間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但在雌性中是中、低海拔顯著大于高海拔，而在雄性中是低海拔顯著大于中、高海拔(海拔*性別：P<0.001)。

除肺臟和脾臟的干重?zé)o性別差異外，其他臟器的干重均為雌性大于雄性。除脂肪體外，協(xié)變量SVL均與臟器干重顯著正相關(guān)。除肺臟外，各臟器干重在樣線間均存在差異，且表現(xiàn)為岷江樣線的干重大于大渡河樣線的干重。除心臟和脂肪體外，肝臟、肺臟、腎臟和脾臟的干重隨馴化時間有增大趨勢(表2，表3)。

表3 不同海拔中華蟾蜍的測量值Table 3 Measurement of Bufo gargarizans under different altitudes

Pearson相關(guān)分析表明，心臟干重與肝臟、肺臟、腎臟、脂肪體的干重均為顯著正相關(guān)(P<0.001，r為0.623～0.826；表4)，但心臟干重與脾臟干重?zé)o顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.779，r=0.023)。

表4 中華蟾蜍各器官干重的相關(guān)關(guān)系Table 4 The linear correlation between dry mass of different organs of Bufo gargarizans

3 討論

中華蟾蜍心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脂肪體的相對質(zhì)量隨海拔增加而變小，但脾臟無明顯變化。此結(jié)果和假設(shè)一致，即在遺傳或發(fā)育水平上，心臟及其關(guān)聯(lián)代謝器官隨海拔增加而變小，符合反海塞規(guī)則，暗示中華蟾蜍主要是通過降低代謝負(fù)荷適應(yīng)高海拔環(huán)境。

增加心臟大小可提高代謝水平，有利于哺乳動物和鳥類等內(nèi)溫動物獲得更多的能量保證自身的存活和繁殖(Piersmaetal.，1996；Hammondetal.，1999；Cavieres &Sabat，2008；Liaoetal.，2010；Mulleretal.，2014；Gilloolyetal.，2017)。但本研究表明，中華蟾蜍的心臟沿海拔變小，提示外溫動物與內(nèi)溫動物應(yīng)對高海拔環(huán)境的模式存在差異。從進(jìn)化遠(yuǎn)因分析，提高代謝水平、獲得能量需要付出適合度代價：例如，隨著能量代謝水平的升高，需要同化的食物資源增加，搜尋食物的時間延長、空間變大，動物可能面臨更大的捕食風(fēng)險；同時，更大的心臟也需要更多的能量維持。雜食性的小型哺乳動物、鳥類由于食譜較寬，可利用的食物資源豐富，運(yùn)動速度快，躲避天敵能力強(qiáng)，增加心臟質(zhì)量的適合度收益可能超過上述生態(tài)和生理代價；但兩棲類等外溫動物的食譜相對較窄(大多為專性食蟲)，運(yùn)動和遷移速度較慢，隨著海拔升高，與心臟變大、基礎(chǔ)代謝升高關(guān)聯(lián)的適合度代價(如捕食風(fēng)險增加)可能遠(yuǎn)超過其與代謝增加相關(guān)的適合度收益(如活動水平提高、同化能力增強(qiáng))，進(jìn)而驅(qū)動棲居于高海拔的外溫動物進(jìn)化出較低的代謝支出及更小的心臟(Sears，2005)。研究發(fā)現(xiàn)，野外直接取樣的中華蟾蜍的心臟大小不隨海拔而變化(Zhaoetal.，2019)?；诒狙芯康慕Y(jié)果推測，心臟大小不同梯度間的表型相似性可能是環(huán)境因素誘導(dǎo)的表型可塑性與遺傳或發(fā)育可塑性效應(yīng)疊加所致。然而，哪些環(huán)境因素及如何在表型可塑性水平影響中華蟾蜍心臟的形態(tài)大小還知之甚少。適度饑餓可誘導(dǎo)中華蟾蜍心臟濕重變大(張瑩等，2017)，提示食物的可利用性是一個潛在因素。

肝臟和脂肪體是兩棲動物體內(nèi)主要的能量貯存器官，在應(yīng)對短期和長期能量應(yīng)激挑戰(zhàn)中具有重要作用(金晨晨等，2014；張瑩等，2017)。高海拔或高緯度地區(qū)的個體為了應(yīng)對該環(huán)境下高水平的不確定性、度過較長的冬眠期和滿足隨后的繁殖需求，理論上需要儲備更多的能量，進(jìn)化出更大的肝臟和脂肪體。例如，與低緯度地區(qū)采集的個體相比較，高緯度地區(qū)的歐洲林蛙Ranatemporaria和中國林蛙R.chensinensis均具有更大的肝臟和脂肪體(Jonssonetal.，2009；Chenetal.，2011)。然而，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)高海拔的中華蟾蜍具有更大的肝臟和脂肪體。這種不一致性有2種可能的解釋：一是由于心臟變小，高海拔個體的能量消耗減少，因此能量儲存相應(yīng)下降。在林蛙中觀察到的能量儲存增加的現(xiàn)象主要與環(huán)境馴化有關(guān)，而非遺傳等固定效應(yīng)引起(Jonssonetal.，2009)；另一種可能性是高海拔種群能量儲存增加需要環(huán)境因子和遺傳因素的交互作用才能表現(xiàn)出來。例如，生活在高緯度地區(qū)的敘利亞倉鼠Phodopussungorus啟動體脂含量變化需要光周期信號(Tupsetal.，2004)。高海拔環(huán)境下，低氧和低溫對于肺臟是相互拮抗的選擇壓力，低氧促進(jìn)肺臟變大，低溫則促進(jìn)肺臟變小。本研究中，中華蟾蜍的肺臟隨海拔升高而變小，提示其主要是受到低溫的選擇作用。此外，中華蟾蜍腎臟大小隨著海拔升高也減小，這與小型哺乳動物的模式相似，可能是腎臟對低溫環(huán)境中水代謝水平下調(diào)的適應(yīng)結(jié)果(Hammondetal.，2001)。此外，上述器官與心臟的大小在個體水平上顯著正相關(guān)，提示海拔對心臟及這些功能相關(guān)器官存在關(guān)聯(lián)選擇，但這需要進(jìn)一步的數(shù)量遺傳學(xué)分析予以驗(yàn)證。

脾臟是脊椎動物體內(nèi)最大的免疫器官，其質(zhì)量是衡量動物免疫功能的一個重要形態(tài)指標(biāo)(Nelson &Demas，1996；金晨晨等，2014；張志強(qiáng)，2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，中華蟾蜍的脾臟質(zhì)量隨海拔增加沒有變化，這與我們對其天然免疫能力沿海拔變化的模式并不一致(未發(fā)表數(shù)據(jù))。值得注意的是，脾臟和肺臟質(zhì)量存在顯著的相關(guān)性，暗示二者在功能上的關(guān)聯(lián)和整合。此外，雌性的各臟器普遍大于雄性，推測這與雌性繁殖能量代價相關(guān)，但這與野外其他兩棲類的發(fā)現(xiàn)并不一致(Garofaloetal.，2006；Jonssonetal.，2009)。這可能與逆梯度選擇的性別差異有關(guān)，但需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。此外，與肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等實(shí)質(zhì)臟器相比，心臟大小沒有隨馴化時間發(fā)生變化，暗示與其他內(nèi)臟器官相比，心臟的表型彈性最小。最后，樣線間的差異暗示這2條水系中的中華蟾蜍可能經(jīng)歷了不同的環(huán)境選擇壓力。