孫 倩, 戴浩強(qiáng), 陳佩佩, 佘 慧, 武 佳*

(1. 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院檢驗科, 浙江 寧波 315040; 2. 溫州醫(yī)科大學(xué), 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室, 浙江 溫州 325035)

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters, PAEs)物質(zhì)是一類典型的環(huán)境激素或內(nèi)分泌干擾物,可以蓄積在人體內(nèi)并導(dǎo)致機(jī)體的突變與紊亂[1,2]。PAEs作為一類常用的塑料增塑劑,其污染物普遍存在于空氣、地表水、土壤等環(huán)境樣品中,人類可通過呼吸、食物、皮膚接觸、靜脈注射等途徑攝入該物質(zhì)[1-3]。PAEs在人體內(nèi)發(fā)生代謝,常見的PAEs代謝物有鄰苯二甲酸單乙酯(monoethyl ester, MEP)、鄰苯二甲酸單丁酯(mono-n-butyl phthalate, MBP)、鄰苯二甲酸單異丁酯(1-(2-methylpropyl) ester, MIBP)、鄰苯二甲酸單芐酯(1,2-benzene dicarboxylic acid, 1-(phenylmethyl) ester, MBZP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(2-ethylhexyl hydrogen phthalate, MEHP)。較多研究表明鄰苯二甲酸單酯代謝物具有更強(qiáng)的生物活性[4-10],例如MEHP、MIBP、MBZP與空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型相關(guān)性強(qiáng)。PAEs代謝物不僅能引起兒童的過敏性疾病、哮喘、濕疹、炎癥等[11],也導(dǎo)致青少年體內(nèi)的胰島素耐受性增強(qiáng)[12,13],還與兒童高血壓有相關(guān)聯(lián)系[14]。它在體內(nèi)的持續(xù)內(nèi)暴露與老年人、婦女患糖尿病均相關(guān)[15,16]。

PAEs在人體內(nèi)半衰期短,主要經(jīng)歷兩個步驟:①鄰苯二甲酸酯被水解為初級代謝物——鄰苯二甲酸單酯;側(cè)鏈長的PAEs還會進(jìn)一步發(fā)生羥基化和氧化反應(yīng)。②鄰苯二甲酸單酯、羥基化產(chǎn)物和氧化產(chǎn)物在尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成親水的葡萄糖苷酸結(jié)合物;然后經(jīng)尿液排出[5,6]。因此,將尿液中的PAEs羥基化代謝產(chǎn)物作為生物標(biāo)志物,從而了解人群對PAEs的暴露水平及特征;同時,研究代謝產(chǎn)物可以很好地避免實驗室環(huán)境中無處不在的鄰苯二甲酸酯類本底值的干擾[17]。由于人們普遍暴露于鄰苯二甲酸酯這類環(huán)境激素中,因此全面地評價該物質(zhì)通過呼吸、飲食、飲水、皮膚接觸等暴露途徑進(jìn)入人體產(chǎn)生健康效應(yīng)是亟須開展的工作。所以,建立精準(zhǔn)、可靠的分析方法對監(jiān)督人類健康十分重要。

PAEs代謝物在尿液中的濃度非常低,無法用儀器直接分析,因此分析前需對樣品進(jìn)行濃縮富集,主要的方法有固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)、液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、液相微萃取法(liquid-phase microextraction, LPME)和固相微萃取法(solid-phase microextraction, SPME)。分散液液微萃取法(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)是一種操作簡單、快速、富集倍數(shù)高的萃取方法[18-20],被廣泛應(yīng)用于樣品預(yù)處理中。但在萃取過程中常使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑作為萃取劑。近年來,室溫離子液體(ionic liquid, IL)由于其具有較好的熱穩(wěn)定性、不揮發(fā)性以及對有機(jī)物強(qiáng)的萃取能力,同時還具有可設(shè)計性等獨特的物理化學(xué)性質(zhì),成為傳統(tǒng)揮發(fā)性有機(jī)溶劑的“綠色”替代品[18,19]。Sun等[21]構(gòu)建了一種無有機(jī)溶劑的IL-DLLME技術(shù),在這種方法中,親水性離子液體[EMIM][BF4]用作分散溶劑,以幫助萃取溶劑疏水性離子液體[C8MIM][PF6]完全分散,在萃取反應(yīng)體系中未使用有機(jī)溶劑。吳翠琴等[18]建立了懸浮固化分散液液微萃取(SFO-DLLME)前處理方法檢測水體中的6種PAEs,在萃取過程中也未使用有機(jī)試劑,綠色環(huán)保,并獲得了較高的回收率?；谏鲜鲅芯勘尘?本文擬建立多功能離子液體DLLME技術(shù),檢測人體尿液中的鄰苯二甲酸酯代謝物,并對影響萃取效率的各單因素進(jìn)行優(yōu)化。最后將該方法應(yīng)用于糖尿病患者尿液樣品中鄰苯二甲酸酯類化合物內(nèi)暴露評價,為研究鄰苯二甲酸酯類暴露水平積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司); BS110S電子分析天平(德國賽多利斯公司,精密度0.1 mg); Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司); KH-100B型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、pH計(美國ThermoFisher公司)。

PAEs代謝物標(biāo)準(zhǔn)品(MEP、MBP、MIBP、MBZP、MEHP,純度>98%)購于美國AccuStand公司。離子液體(純度>99.5%): 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4MIM]PF6), 1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C6MIM]PF6), 1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸([C8MIM]PF6), 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽的離子液體([C4MIM]BF4), 1-丁基磺酸-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸鹽[BSO3HMIm][OTf]和六氟磷酸銨(NH4PF6)購自上海成捷化學(xué)有限公司。色譜級甲醇、乙腈、丙酮、甲酸、乙酸等購于上海百靈威公司;β-葡萄糖苷酸酶購于美國Sigma公司。實驗用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)純化的純凈水。

10份Ⅱ型糖尿病患者尿液樣本從醫(yī)院收集,患者均已簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及系列標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別稱取5種PAEs代謝物標(biāo)準(zhǔn)品100 mg(精確至0.01 mg),置于25 mL容量瓶中,用甲醇配制質(zhì)量濃度為4.0 g/L的單標(biāo)儲備液,于-40 ℃儲存。用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、10、20、40、80、100、200、400、800、1 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于4 ℃保存?zhèn)溆?。取空白尿液?shù)等份,分別加入5種PAEs代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、10、50、100、500和1 000 μg/L的尿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1尿液樣品前處理方法

冷凍尿液先在4 ℃冰箱中解凍,然后放至室溫,充分振蕩后經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾。取過濾后的尿液1 mL,放入玻璃試管中,加入100 μL的β-葡萄糖苷酸酶溶液,于37 ℃的水浴中酶解60 min,在萃取前稀釋5倍。空白尿液制備方法:用1 mL H2O和1 mL甲醇分別對固相萃取小柱進(jìn)行活化,然后將1 mL尿液加入柱中,收集后作為空白尿液。

1.3.2IL-DLLME實驗方法

取5 mL樣品,依次加入35 μL [C8MIM][PF6]、120 μL [C4MIM][BF6]、30 μL [BSO3HMIm][OTf]和0.1 g NH4PF6,充分振蕩,此時將形成霧狀懸濁液,保持體系溫度35 ℃,超聲分散5 min,冷卻5 min, 4 000 r/min下離心5 min,去除上清液,下層黏稠狀I(lǐng)L層用60 μL甲醇稀釋并充分振蕩混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。萃取率(ER)按如下公式計算。

式中:CIL為萃取后離子液體相中PAEs代謝物的濃度;VIL為萃取后離子液體相的體積;Ca為水樣中鄰苯二甲酸酯的濃度;Va為初始水相的體積。

1.3.3色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動相A為0.1%乙酸水溶液,流動相B為0.1%乙酸乙腈溶液。梯度洗脫:0～8 min, 45%B～55%B; 8.1～17 min, 55%B; 17.1～20 min, 80%B; 20.1～25 min, 100%B。流速為1.0 mL/min,柱溫箱溫度為35 ℃,檢測波長為228 nm,進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 DLLME萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取劑種類及體積

在微萃取技術(shù)中,萃取劑的種類及體積是影響萃取效率的關(guān)鍵因素。疏水性IL因其在水中的低溶解度、對目標(biāo)分析物良好的提取能力和良好的色譜行為,常被選作萃取劑。本研究中選用了3種烷基咪唑六氟磷酸鹽疏水性離子液體([C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]、[C8MIM][PF6])作為萃取劑,隨著烷基鏈長度的改變,它們的物理和化學(xué)性能(包括在水中的黏度和溶解度)對懸濁液的組成和沉積相的體積有巨大的影響[22]。按照1.3節(jié)進(jìn)行實驗,每組實驗平行6次,結(jié)果(見圖1a)表明,相同陰離子的IL的萃取效率隨著碳鏈長度的增加而增加,當(dāng)使用[C8MIM][PF6]作為萃取劑時效果最好,MEP、MBP、MIBP、MBZP、MEHP的回收率在89.3%～94.0%范圍內(nèi),因此選用[C8MIM][PF6]作為最佳萃取劑。

圖 1 萃取劑(a)種類和(b)體積對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effect of (a) the type and (b) the volume of extraction solvent on recoveries of PAE metabolites (n=6) MEP: monoethyl phthalate; MBP: mono-n-butyl phthalate; MIBP: mono-iso-butyl phthalate; MBZP: monobenzyl phthalate; MEHP: mono(2-ethylhexyl) phthalate. Conditions: spiked urine sample volume 5.0 mL; dispersants [BSO3HMIm][OTf] 30 μL, [C4MIM][BF6] 120 μL; NH4PF6 0.1 g; extraction at 35 ℃; ultrasonic dispersion for 5 min; cooling in ice water for 5 min; and centrifugation at 4000 r/min for 5 min. For Fig. 1a, extraction solvent volume 35 μL.

考察了不同體積(30～50 μL)的萃取劑[C8MIM][PF6]對5種PAEs代謝物回收率的影響。結(jié)果如圖1b所示,[C8MIM][PF6]的體積在30～50 μL時,隨著[C8MIM][PF6]體積的增大5種PAEs目標(biāo)物的回收率先增大后減小,當(dāng)體積為35 μL時回收率最大(95.3%);可能的原因是,隨著萃取劑用量的增加,體系對PAEs代謝物的萃取效率增加,但萃取劑體積過大,分散劑的體積偏小,破壞了體系的萃取平衡,減小了萃取劑與目標(biāo)物的接觸面積,使得回收率降低。因此,選擇[C8MIM][PF6]的最佳體積為35 μL。

2.1.2分散劑的種類和體積

在傳統(tǒng)的微萃取技術(shù)中,甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、四氫呋喃這些有機(jī)溶劑常被用作分散劑。但是在無有機(jī)溶劑的全離子液體DLLME過程中,親水性的IL取代了有機(jī)溶劑被用作分散劑。比較了[C4MIM][BF6]、乙腈、丙酮、甲醇4種溶劑作為分散劑時的萃取效率。結(jié)果如圖2a, [C4MIM][BF6]、乙腈、丙酮3種試劑作為分散劑時,各目標(biāo)物質(zhì)的回收率均較高(66.7%～93.3%)。但與乙腈、丙酮等傳統(tǒng)有機(jī)試劑相比,[C4MIM][BF6]不但具有不易揮發(fā)、低毒、環(huán)保的優(yōu)點,且具有較高的萃取效率(88.7%～93.3%),因此選擇[C4MIM][BF6]作為分散劑。

同時考察了[C4MIM][BF6]的體積(60～140 μL)對PAEs代謝物回收率的影響。如圖2b所示,分散劑體積為120 μL時回收率最高(86.7%～93.7%)。可能的原因是:分散劑體積較小時,萃取劑不能均勻分散于水相與分析物充分接觸,導(dǎo)致回收率降低;分散劑體積較大時,分析物在水中的溶解度增大而不易被萃取。因此實驗選用[C4MIM][BF6]的最佳體積為120 μL。

圖 2 分散劑(a)種類和(b, c)體積對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of (a) the type and (b, c) the volume of dispersive solvent on recoveries of PAE metabolites (n=6) Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

實驗中同時加入親水性離子液體[BSO3HMIm][OTf]作為分散劑。[BSO3HMIm][OTf]帶有一個SO3H基團(tuán)通過烷基鏈與陽離子共價連接引入作為分散溶劑。由于分析物的存在狀態(tài)與水相的pH值密切相關(guān),且所產(chǎn)生的水解作用影響PAEs代謝物的萃取效率。根據(jù)文獻(xiàn)[21]報道, [BSO3HMIm][OTf]在水溶液中呈酸性。因此,[BSO3HMIm][OTf]具有雙重功能,不僅用作分散劑,又可用作pH調(diào)節(jié)劑,避免額外的pH值調(diào)整。分散劑的體積比直接影響萃取劑的分散度[21],固定[C4MIM][BF6]體積120 μL,考察[BSO3HMIm][OTf]的體積(10～50 μL)對微萃取體系回收率的影響,由結(jié)果(見圖2c)可知,當(dāng)[BSO3HMIm][OTf]用量為30 μL,即[C4MIM][BF4]與[BSO3HMIm][OTf]的體積比為4∶1時,各物質(zhì)的萃取回收率達(dá)到最大值(MEP(93.7%±2.1%)、MIBP(91.3%±3.2%)、MBP(89.3%±4.9%)、MBZP(90.0%±5.1%)、MEHP(97.3%±1.2%))。

2.1.3鹽效應(yīng)

由于分析物的萃取效率受樣品基底的影響很大,根據(jù)“鹽析”原理,在萃取前向樣品溶液中加入一定量的無機(jī)鹽,如NH4PF6等,離子強(qiáng)度的增強(qiáng)有利于降低分析物在水溶液中的溶解度,從而增加其萃取效率[23]。

根據(jù)1.3節(jié)實驗方法,固定[C4MIM][BF6]體積為120 μL,向微萃取體系中加入不同量(0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 g)的NH4PF6鹽,由圖3可知,當(dāng)添加0.1 g NH4PF6時,各PAEs代謝物的回收率達(dá)到最大值,但隨著添加NH4PF6質(zhì)量的增加,MIBP、MBP、MBZP等物質(zhì)的回收率有所降低。這可能是因為增加離子強(qiáng)度,會降低PAEs在水相中的溶解度,提高其在有機(jī)相中的分配系數(shù);但當(dāng)鹽濃度過大時,樣品溶液的黏度變大,目標(biāo)物與鹽離子之間的靜電作用力增強(qiáng),導(dǎo)致其傳質(zhì)能力降低,從而降低了回收率。因此,本實驗選擇加入0.1 g的NH4PF6。

圖 3 萃取體系中NH4PF6的加入量對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effects of amount of NH4PF6 on recoveries of PAE metabolites (n=6) Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

2.1.4萃取溫度、超聲時間、冷卻時間與離心時間

萃取溫度會影響分析物的分配系數(shù)和IL在水中的溶解度[24]。溫度升高,IL的親水性增加,從而使IL在水中的溶解度增加。不同陽離子的IL,其熱分解溫度相似,但隨著陰離子親水性的增強(qiáng),熱分解溫度降低。在較低的溫度范圍內(nèi),IL能夠穩(wěn)定存在,但如溫度過高,PAEs在水中的溶解度也會相應(yīng)增加,此時被萃取到IL相中的PAEs會減少,降低萃取效率?？疾觳煌腿囟?25～60 ℃)對PAEs代謝物回收率的影響,結(jié)果如圖4a所示,在25～35 ℃之間,各物質(zhì)回收率逐漸增加并達(dá)到最大值,但溫度高于35 ℃時,PAEs代謝物的回收率迅速下降,分析原因可能是由于體系溫度過高導(dǎo)致IL在水相中的溶解度增加,分析物又重新溶于水中導(dǎo)致萃取回收率降低。因此,選擇35 ℃為最佳萃取溫度。

圖 4 萃取條件對PAEs代謝物回收率的影響(n=6)Fig. 4 Effect of extraction conditions on the recoveries of PAE metabolites (n=6) a. extraction temperature; b. sonication time; c. cooling time; d. centrifugation time. Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

圖4b～d分別考察了超聲萃取和離心過程中時間對PAEs代謝物回收率的影響。結(jié)果表明:當(dāng)超聲5 min時,回收率最高(見圖4b)。萃取時間被認(rèn)為是從超聲處理的結(jié)束到離心分離之間的間隔[21]。由結(jié)果(見圖4c)可知冷卻時間為5 min時,各物質(zhì)的回收率達(dá)到最大值。另外,如圖4d所示,離心時間5 min時,各物質(zhì)的回收率達(dá)到最大值。因此,選擇體系的超聲時間為5 min,冷卻時間為5 min,離心時間為5 min。

2.2 方法性能評價

2.2.1線性范圍、檢出限與定量限

將尿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3節(jié)萃取步驟處理并進(jìn)行色譜分析后,以各PAEs代謝物的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實驗結(jié)果表明:各PAEs代謝物在0.5～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,決定系數(shù)(R2)≥0.995 5,檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOD,S/N=10)分別是0.16～0.19 μg/L和0.53～0.63 μg/L(見表1)。

表 1 尿液中5種PAEs代謝物的線性范圍、回歸方程、決定系數(shù)和檢出限

2.2.2加標(biāo)回收率和精密度試驗

取空白尿液數(shù)等份,分別加入不等量的5種PAEs代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成低、中、高加標(biāo)量分別為5、20和100 μg/L的樣品,每個濃度平行6個樣品,按照1.3節(jié)處理和分析樣品,計算回收率,結(jié)果見表2。可以看出,低、中、高水平下的回收率為92.9%～105.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5.96%,有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

同時考察了低中高加標(biāo)濃度下的各組分的日內(nèi)、日間精密度,各組分的RSD均小于8%之內(nèi)(其中高水平加標(biāo)濃度下的RSD值)見表2,說明方法的精密度較好。

表 3 新方法和已發(fā)表方法的比較

表 2 尿樣中5種PAEs代謝物在3個加標(biāo)水平下的回收率及RSDs(n=6)

圖5a為尿液樣品添加中濃度(20 μg/L)PAEs代謝物的典型色譜圖,圖5b為實際尿液樣品的色譜圖。在每次樣品分析前,均進(jìn)行質(zhì)量控制(使用空白溶劑及添加中濃度的尿液樣品),樣品的測定值均在真實值的±20%以內(nèi),本方法符合方法學(xué)構(gòu)建的各項指標(biāo),能夠滿足痕量檢測的分析要求。

圖 5 (a)加標(biāo)尿液樣品和(b)實際尿液樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of a spiked urine sample and a real urine samplea. a blank urine sample spiked with 20 μg/L of five PAE metabolites; b. a real urine sample.

2.2.3與其他方法的比較

將所建立的方法與其他已發(fā)表的方法進(jìn)行比較,由表3可以看出,本文所建方法在萃取時間和操作簡便程度方面與SPE/GC-MS和SPE/LC-MS等前處理方法相比具有明顯優(yōu)勢,且檢出限低。新方法只使用了IL即可完成萃取過程,環(huán)境友好,不需要昂貴的分析儀器。

2.3 實際樣品的分析

實際樣品檢測結(jié)果(見表4)表明,5種PAEs代謝物均有不同程度的檢出。MEP僅有一份檢出,檢出量為6.05 μg/L; MIBP檢出量為18.0～51.6 μg/L; MBP檢出量為49.2～79.6 μg/L; MBZP檢出量為22.1～29.1 μg/L; MEHP檢出量為11.8～47.0 μg/L。表5為計算后的各物質(zhì)和尿液肌酐含量比值以及HMDB數(shù)據(jù)庫(The human metabolome database. http:/ /www.hmdb.ca, 2013)中正常人群尿樣中PAEs代謝物的參考值。

表 4 糖尿病患者尿樣中PAEs代謝物的含量

表 5 糖尿病患者尿樣中5種物質(zhì)的檢測水平及HMDB數(shù)據(jù)庫中正常人群參考范圍

3 結(jié)論

本研究將多功能離子液體與分散液液微萃取技術(shù)相結(jié)合,建立了測定尿液中5種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)代謝產(chǎn)物的高靈敏度新方法。本方法在萃取過程中未使用有機(jī)有毒試劑,綠色環(huán)保、簡便快速,回收率較高,線性范圍較寬,定量限較低,重復(fù)性較好,能夠滿足痕量PAEs檢測分析要求。通過本研究,初步了解環(huán)境激素鄰苯二甲酸酯類在人體內(nèi)的代謝情況及對人體產(chǎn)生的危害,加強(qiáng)了對環(huán)境保護(hù)重要性的認(rèn)識。本研究的初步結(jié)果表明,中國糖尿病患者主要暴露于MBP、MIBP和MEHP。該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好,后期需進(jìn)一步結(jié)合毒理學(xué)和流行病學(xué)來探討PAEs暴露水平對中國人群健康造成的影響,為預(yù)防PAEs危害提供科學(xué)依據(jù)。