楊亞玲，周 寧，黃 丹

結(jié)直腸癌是發(fā)生于結(jié)腸與直腸的常見惡性腫瘤，目前認(rèn)為主要是環(huán)境因素與遺傳因素綜合作用的結(jié)果[1]。由于該疾病早期無(wú)明顯癥狀，一旦確診，患者往往處于疾病的中晚期，故結(jié)直腸癌的早期診斷對(duì)患者的治療及預(yù)后具有重要意義[2]。過(guò)氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α(peroxisome proliferator ivated receptor γ coactivator-1α， PGC-1α)是一種能與多種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生反應(yīng)的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，該因子與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有緊密聯(lián)系[3]。而核因子-κB(nuclear factor-κB， NF-κB)p65則被證實(shí)在腫瘤組織中參與細(xì)胞增殖等多個(gè)步驟[4]。本研究分析結(jié)直腸癌患者PGC-1α和NF-κB p65的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2015年11月—2017年11月收治的75例結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，均經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢證實(shí)。男42例，女33例，年齡25～76(59.31±8.65)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受化療、放療等抗癌輔助治療；本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，臨床資料均完整；無(wú)其他惡性疾病；患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝、腎、心臟等臟器嚴(yán)重疾病者；妊娠期或哺乳期婦女；合并嚴(yán)重神經(jīng)功能、認(rèn)知功能障礙者；嚴(yán)重高血壓、糖尿病、冠心病者；有藥物過(guò)敏史者。

1.2儀器與試劑 10%甲醛溶液、石蠟、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR儀(美國(guó)ABI-7500 Real-Time PCR)、磷酸鹽緩沖液(PBS，北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)、免疫組化二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、PGC-1α抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1PGC-1α表達(dá)檢測(cè)：由相關(guān)專業(yè)操作人員用Trazol溶液將黏膜組織樣本的總RNA進(jìn)行提取，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明合成cRNA。合成完畢后取2組cDNA 5 μl，將其作為模板，再分別加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并經(jīng)過(guò)高溫變性、循環(huán)，再進(jìn)行PCR儀檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參考DL2000 marker分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紫外凝膠掃描成像，該樣本的表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度則為與樣本內(nèi)對(duì)照β-actin的熒光強(qiáng)度比值。

1.3.2NF-κB p65表達(dá)檢測(cè)：取受檢者黏膜組織，在30 min內(nèi)將黏膜組織置于10%甲醛溶液中固定浸泡，予以石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇予以脫水，并使用枸櫞酸鹽修復(fù)液對(duì)組織進(jìn)行3 min的高壓修復(fù)，修復(fù)完成后用免疫組化筆在受檢組織1～2 mm外劃圈，再加入3% H2O2放置于恒溫箱中孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶干擾，并運(yùn)用磷酸鹽緩沖液漂洗，漂洗3次后加入適量的10%正常羊血清于室溫下密閉15 min，棄血清，并以1∶500的稀釋比例滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗體放置于4℃的恒溫箱中過(guò)夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。各組標(biāo)本均將PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以自身對(duì)照作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 PGC-1α、NF-κB p65免疫組化結(jié)果判定[5]：由兩位病理科醫(yī)生在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞數(shù)量和染色程度評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量<1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分；染色程度:無(wú)染色為0分，弱陽(yáng)性顯黃色為1分，中等陽(yáng)性顯淺棕色為2分，強(qiáng)陽(yáng)性顯棕褐色為3分。將二者所得分?jǐn)?shù)合計(jì)：無(wú)表達(dá)或低表達(dá)為0～3分，高表達(dá)為4～6分。

2 結(jié)果

2.1PGC-1α與NF-κB p65在不同組織中的表達(dá) PGC-1α與NF-κB p65在癌組織中高表達(dá)率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 PGC-1α與NF-κB p65在結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況[例(%)]

2.2PGC-1α表達(dá)與結(jié)直腸癌癌組織臨床病理特征的關(guān)系 PGC-1α在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)率與腫瘤分化程度呈反比(P<0.01)；TNMⅠ～Ⅱ期、淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移且(或)無(wú)血管侵犯的結(jié)直腸癌患者PGC-1α表達(dá)率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、血管受侵犯的患者(P<0.01)；而患者年齡、性別、腫瘤大小與PGC-1α表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 PGC-1α水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征關(guān)系(例)

2.3NF-κB p65表達(dá)與結(jié)直腸癌癌組織臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌癌組織中NF-κB p65的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)；TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、有血管侵犯、腫瘤分化程度低的患者NF-κB p65的表達(dá)明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期、腫瘤分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)血管侵犯患者(P<0.01)。見表3。

表3 NF-κB p65與結(jié)直腸癌臨床病理特征關(guān)系(例)

2.4PGC-1α與NF-κB p65表達(dá)與結(jié)直腸癌病理特征的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)進(jìn)行分析，結(jié)直腸癌患者PGC-1α與NF-κB p65的表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，與TNM分期、血管侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.01)。見表4。

表4 PGC-1α與NF-κB p65與結(jié)直腸癌病理特征的相關(guān)性

2.5預(yù)后情況 隨訪2年后，75例結(jié)直腸癌患者2年總生存率為73.33%(55/75)。PGC-1α高表達(dá)和低表達(dá)的2年總生存率分別為74.14%(43/58)、70.59%(12/17)，不同表達(dá)水平生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NF-κB p65高表達(dá)和低表達(dá)的2年總生存率分別為73.08%(38/52)、73.91%(17/23)，不同表達(dá)水平生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)生于結(jié)、直腸及肛管黏膜上皮的惡性腫瘤，患者預(yù)后較差，病死率較高，對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重威脅[6]。近20多年來(lái)，世界上多數(shù)國(guó)家結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而我國(guó)的發(fā)病率上升趨勢(shì)也十分明顯[7]。而關(guān)于早期診斷、治療以及相關(guān)分子生物學(xué)研究一直是臨床研究的熱點(diǎn)，有大量文獻(xiàn)指出，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖、分化失控及凋亡障礙等因素密切相關(guān)[8]。

PGC-1α是一種通過(guò)與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并對(duì)其基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后的剪接修飾予以調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子[9]。近年來(lái)有大量文獻(xiàn)已經(jīng)證明PGC-1α與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，PGC-1α的表達(dá)在前列腺癌、胃癌中均呈高水平狀態(tài)，該因子還可誘導(dǎo)乙型肝炎病毒發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生，對(duì)癌癥的發(fā)展具有促進(jìn)作用[10-11]。而也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，PGC-1α可誘導(dǎo)雌激素相關(guān)受體，從而使前列腺癌的轉(zhuǎn)移受到抑制；在乳腺癌癌細(xì)胞不斷增殖時(shí)，PGC-1α可通過(guò)miRNA的作用減少癌細(xì)胞的增殖[12-13]，提示PGC-1α不僅是一種促癌因子，通過(guò)相關(guān)信號(hào)因子與癌基因的調(diào)控還可成為一種抑癌因子，該結(jié)論對(duì)惡性腫瘤靶向治療的研究提供了方向[14-15]。

NF-κB是一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括p65和p50兩種亞型，對(duì)多種細(xì)胞因子、黏附因子以及生長(zhǎng)因子的表達(dá)具有調(diào)控作用，與炎癥的發(fā)生也存在關(guān)聯(lián)。有相關(guān)研究證明，NF-κB在腫瘤組織中表達(dá)過(guò)量將加速腫瘤的發(fā)展，而NF-κB p65在細(xì)胞中主要參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[16-17]。有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NF-κB p65在正常組織、炎性組織及癌組織中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，其基因敲除將導(dǎo)致小鼠的死亡[18]。本研究結(jié)果顯示，NF-κB p65、PGC-1α在結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織，這有效驗(yàn)證了上述研究結(jié)果，也在一定程度證明了NF-κB p65、PGC-1α表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了不可或缺的作用，有可能隨著病情的發(fā)展其表達(dá)水平逐漸升高。

本研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65、PGC-1α的表達(dá)與患者年齡及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性，而與結(jié)直腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯程度呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示NF-κB p65、PGC-1α參與了結(jié)直腸癌病變過(guò)程，在一定程度可能對(duì)腫瘤細(xì)胞及相關(guān)因子的分泌和增殖產(chǎn)生了促進(jìn)作用，這與吳安定等[19]研究結(jié)果一致。

通過(guò)我們對(duì)手術(shù)后患者2年的隨訪，分析NF-κB p65及PGC-1α表達(dá)與患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示二者表達(dá)的差異對(duì)結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存情況無(wú)影響，而王婷婷等[20]研究結(jié)果顯示，PGC-1α的表達(dá)與患者病情發(fā)展呈一致性，本研究與其存在一定的差異性，考慮為本研究病例數(shù)及隨訪時(shí)間有限所致，具體情況還需進(jìn)一步予以討論研究。

綜上所述，NF-κB p65與PGC-1α表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及血管侵犯等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，臨床可根據(jù)NF-κB p65與PGC-1α表達(dá)情況對(duì)患者病情進(jìn)行診斷與治療指導(dǎo)。