杜超群， 許業(yè)洲， 孫曉梅

(1.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北武漢430075；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091)

種子園的建立是針葉樹(shù)育種最有效的方法之一。種子園通過(guò)有性過(guò)程生產(chǎn)改良種子，既要獲得較高的遺傳增益，又必需保持較寬的遺傳基礎(chǔ)[1]，保證所生產(chǎn)的種子具有一定的遺傳多樣性，這對(duì)確保種子育苗所營(yíng)造的林分具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，尤其對(duì)避免極端氣候等環(huán)境因子造成林分損失至關(guān)重要[2]。

日本落葉松[Larix kaempferi(Lamb.)Carr.]在我國(guó)已有一百多年的引種栽培歷史，是我國(guó)北方重要的用材樹(shù)種之一，目前已成為鄂西亞高山地區(qū)的主要造林樹(shù)種。湖北省建始縣長(zhǎng)嶺崗林場(chǎng)是我國(guó)南方唯一的日本落葉松國(guó)家良種基地，該基地營(yíng)建的日本落葉松種子園是當(dāng)?shù)丶爸苓叺貐^(qū)主要的種子來(lái)源地，近20 a累計(jì)供應(yīng)良種超過(guò)3 000 kg，大大提高了該區(qū)域日本落葉松人工林的良種化水平[3]。針對(duì)日本落葉松種子園的早期研究大多是基于表型數(shù)據(jù)的評(píng)估和選擇[3-5]。由于建園的材料來(lái)源于多個(gè)省份，可推測(cè)其遺傳多樣性十分豐富，但其遺傳多樣性的現(xiàn)狀及特點(diǎn)目前尚未有研究報(bào)道。目前日本落葉松種子園仍然同時(shí)具有生產(chǎn)群體和育種群體的功能，只有清楚地掌握種子園群體的遺傳基礎(chǔ)和遺傳結(jié)構(gòu)，才能確保大規(guī)模人工造林的生態(tài)安全，才能有效地開(kāi)展具有發(fā)展?jié)摿Φ男缕贩N創(chuàng)制[6]。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記已成為生物信息學(xué)最重要的研究手段之一。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)物種各群體遺傳學(xué)參數(shù)及親緣關(guān)系的快速分析[6]，已被普遍應(yīng)用于群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等研究中[7]，其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記由于具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、信息量大和共顯性等優(yōu)越性，且在種間的通用性高，能夠很好地滿足遺傳多樣性等研究要求[8-9]。目前，雖然SSR標(biāo)記已被用于日本落葉松遺傳多樣性的研究中[10-12]，但報(bào)道不多，而且以往的研究所涉及的SSR標(biāo)記數(shù)量較少。本研究以湖北省建始縣長(zhǎng)嶺崗林場(chǎng)日本落葉松改良種子園無(wú)性系為對(duì)象，利用本課題組開(kāi)發(fā)出來(lái)的、多態(tài)性較好的16個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(expressed sequence tag-SSR，EST-SSR)標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析和評(píng)價(jià)，旨在明確種子園的遺傳基礎(chǔ)，為后期育種策略的制定和遺傳改良的可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

日本落葉松改良種子園位于湖北省建始縣長(zhǎng)嶺崗林場(chǎng)日本落葉松國(guó)家良種基地，北緯30°48′，東經(jīng)110°03′，海拔1 600～1 720 m，屬內(nèi)陸性冷涼氣候帶高山多雨潮濕區(qū)，年平均氣溫7～8℃，平均最低氣溫-9.4℃，年降水量1 600～1 800 mm，土壤為山地黃棕壤。該種子園的建園時(shí)間為1989—1997年，面積49.5 hm2，是在初級(jí)種子園的基礎(chǔ)上通過(guò)去劣留優(yōu)改建而成的，建園的材料為來(lái)自遼寧、山東、內(nèi)蒙古、甘肅及本場(chǎng)母樹(shù)林的優(yōu)樹(shù)穗條，以2年生實(shí)生苗為砧木嫁接成無(wú)性系，初植密度為416～625株·hm-2。2008年，根據(jù)生長(zhǎng)和結(jié)實(shí)情況對(duì)種子園進(jìn)行去劣疏伐，保留密度為250～318株·hm-2，保存無(wú)性系145個(gè)，不同來(lái)源的群體分別標(biāo)記為湖北(Hubei，HB)、遼寧(Liaoning，LN)、內(nèi)蒙古(Inner Mongolia，IM)、山東(Shandong，SD)、甘肅(Gansu，GS)，具體情況如表1所示。

表1 種子園材料來(lái)源Table 1 Seed orchard material source

1.2 試驗(yàn)方法

采集種子園145個(gè)無(wú)性系(每系號(hào)1株)的嫩葉，硅膠干燥后置于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆?。采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB)法提取基因組DNA[10]。試驗(yàn)所用的16個(gè)SSR標(biāo)記見(jiàn)表2，引物信息與CHENetal[12]相同，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。標(biāo)記擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取整理等參照CHENetal[12]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlex 6.41軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括遺傳參數(shù)的估算、各位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)卡方檢驗(yàn)、分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)、群體間遺傳距離和遺傳相似性以及主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)。估算的遺傳參數(shù)有:觀測(cè)等位基因數(shù)(number of observed alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles，Ne)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、Shannon多樣性指數(shù)、群體內(nèi)近交系數(shù)(inbreeding coefficient in population，F(xiàn)is)、群體總近交系數(shù)(total inbreeding coefficient of population，F(xiàn)it)、基因分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient，F(xiàn)st)、基因流(gene flow，Nm)。利用Power Marker version 3.25軟件計(jì)算群體多態(tài)性信息含量指數(shù)(polymorphism information content index，PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)多態(tài)性分析

16對(duì)引物的多態(tài)性表現(xiàn)見(jiàn)表2。145份材料共檢測(cè)到82個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的Na為2～12個(gè)不等，平均Ne為2.542，平均Ho為0.578，平均He為0.528，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.972。其中QL397位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，Ne和He最大(分別為5.831和0.828)，Shannon多樣性指數(shù)最高(1.966)；HL391位點(diǎn)的Ne和He最小(分別為1.192和0.158)，Shannon多樣性指數(shù)最低(0.315)，說(shuō)明各個(gè)位點(diǎn)對(duì)研究群體遺傳多樣性的檢測(cè)能力和效果不同。16個(gè)位點(diǎn)的PIC在0.156～0.818之間，平均值為0.485，其中PIC大于0.500的位點(diǎn)有9個(gè)，為高度多態(tài)性位點(diǎn)，表明所選SSR引物能有效揭示群體遺傳多樣性。

表2 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析Table 2 Polymorphism analysis of SSR primers

2.2 位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡卡方檢驗(yàn)

16個(gè)SSR位點(diǎn)的F統(tǒng)計(jì)量檢測(cè)結(jié)果顯示(表3)，日本落葉松改良種子園的Fst平均值為0.023，說(shuō)明群體間遺傳分化程度較??；Fis、Fit均為負(fù)值，群體表現(xiàn)為輕微雜合子過(guò)量，不存在近交衰退；Nm平均值為13.932，遠(yuǎn)高于自然群體，也說(shuō)明遺傳分化較小[2]。

表3 F統(tǒng)計(jì)量和基因流Table 3 Summary of F-statistics and gene flow

分別對(duì)不同來(lái)源的5個(gè)群體進(jìn)行HWE卡方檢驗(yàn)(表4)，整體來(lái)看，5個(gè)群體中大部分位點(diǎn)均符合HWE(P≥0.05)，其中GS群體所有位點(diǎn)均符合，HB和IM群體均有1個(gè)位點(diǎn)偏離平衡，LN群體中偏離平衡的位點(diǎn)最多(4個(gè))。另外分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)H52位點(diǎn)在4個(gè)群體中均顯著偏離HWE。

表4 不同群體各位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡卡方檢驗(yàn)Table 4 HWE chi-square test for each locus of different populations

2.3 群體遺傳多樣性參數(shù)比較

5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表5。群體之間各參數(shù)值相差不大，Ne在2.363～2.675之間，Ho為0.559～0.600，He為0.507～0.545，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.933～1.007。在遺傳多樣性評(píng)價(jià)中，多用Shannon多樣性指數(shù)、He和Ne這3個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量群體遺傳多樣性的大小[2，6，9]。相對(duì)來(lái)說(shuō)，LN群體的Ne和Shannon多樣性指數(shù)最高，IM群體最低；HB和LN群體的He相等，在5個(gè)群體中最高，IM群體仍為最低。按照Shannon多樣性指數(shù)值進(jìn)行排序，5個(gè)群體遺傳多樣性從高到低的順序?yàn)?LN＞HB＞SD＞GS＞IM。

表5 不同群體遺傳多樣性參數(shù)Table 5 Genetic diversity parameters of different populations

2.4 群體間遺傳分化

通過(guò)計(jì)算群體間遺傳距離和遺傳相似性可知(表6):5個(gè)群體遺傳距離較小，在0.002～0.015之間，遺傳相似性的平均值為0.992。其中遺傳距離最小的群體為SD和GS、HB和LN，遺傳距離最大的為HB和IM之間。AMOVA分析結(jié)果表明，群體間的變異僅占1.71%，98.29%的變異存在于群體內(nèi)，說(shuō)明群體間的遺傳分化非常小?；赟SR遺傳距離的PCoA分析結(jié)果如圖1所示。5個(gè)群體的分布區(qū)域相互交叉重疊，群體之間沒(méi)有明顯的聚集，甚至可以觀察到來(lái)自不同群體的個(gè)體有重合現(xiàn)象，說(shuō)明遺傳基礎(chǔ)比較相似。

3 討論與結(jié)論

日本落葉松原產(chǎn)地位于日本本州島中部山區(qū)，歐洲和北美均有引種，我國(guó)是最早引種的國(guó)家之一，山東省是我國(guó)有歷史記載引種最早的省份，遼寧、吉林、甘肅、內(nèi)蒙古、黑龍江、河南、四川、湖北、湖南等地均有大規(guī)模引種栽培[13]。目前國(guó)內(nèi)所有的資源均為20世紀(jì)引種資源，雖然日本落葉松育種已進(jìn)入第二代，但是二代育種群體主要來(lái)源于種子園子代測(cè)定林[14]，二代生產(chǎn)群體(二代種子園)還未進(jìn)入生產(chǎn)階段，因此，目前改良代種子園仍然是我國(guó)日本落葉松人工林良種的主要來(lái)源，也是國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的重要保障。

表6 群體間遺傳距離(左下角)與遺傳相似性(右上角)Table 6 Genetic distance between populations(lower left)and genetic similarity(upper right)

圖1 基于遺傳距離的主坐標(biāo)分析Figure 1 PCoA analysis based on genetic distance

松屬樹(shù)種的遺傳多樣性研究已獲得較大的進(jìn)展，馬尾松(PinusmassonianaLamb.)種子園Shannon多樣性指數(shù)為0.468～0.477[15]，濕加松(Pinuselliottii×P.oaribaea)親本群體平均雜合度為0.144～0.884[16]，白皮松(PinusbungeanaZucc.)天然群體 He和 Shannon多樣性指數(shù)分別為 0.118～0.333和0.195～0.495[17]，紅松(PinuskoraiensisSieb.et Zucc.)天然群體及種子園Shannon多樣性指數(shù)分別為0.262和0.267[18]，華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtiiMayr.)1～3代種子園的He和Shannon多樣性指數(shù)分別為0.418～0.479和0.705～0.791[2]。本研究對(duì)日本落葉松種子園145個(gè)無(wú)性系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)目為2～12個(gè)，平均Ne為2.542，平均Ho為0.578，平均He為0.528，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.972，平均PIC為0.485。與其他松屬樹(shù)種相比，日本落葉松種子園遺傳多樣性相對(duì)較高。

一般來(lái)說(shuō)，地理環(huán)境比如海拔、經(jīng)緯度等的差異容易使同一物種不同居群之間產(chǎn)生明顯的遺傳分化[9]，如萬(wàn)愛(ài)華等[15]對(duì)來(lái)自8個(gè)省份的馬尾松種子園無(wú)性系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與緯度和地理距離的相關(guān)性均比較明顯；王小平等[19]、趙罕等[17]分析了白皮松群體的地理變異規(guī)律，無(wú)論是表型性狀(球果、種子)還是遺傳結(jié)構(gòu)均存在明顯的差異。日本落葉松種子園不同來(lái)源的群體按照Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行排序，從高到低的順序?yàn)?LN＞HB＞SD＞GS＞IM，但是群體間遺傳多樣性各參數(shù)值差異不大；計(jì)算群體間的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，5個(gè)群體之間遺傳距離較小(0.002～0.015之間)。分子方差分析結(jié)果表明，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，僅有1.71%存在于群體間，說(shuō)明群體間的遺傳分化非常?。籔CoA分析結(jié)果更為直觀地反映出5個(gè)群體遺傳基礎(chǔ)相似，沒(méi)有明顯的聚類。種子園中的材料雖然引自5個(gè)不同省份，但是日本落葉松作為外來(lái)樹(shù)種，直接從原產(chǎn)地引種的機(jī)會(huì)較少，國(guó)內(nèi)種植材料引種交流非常頻繁，因此遺傳背景逐漸趨于類似，檢測(cè)不到明顯的分化。

在多世代育種進(jìn)程中，維持育種群體較寬的遺傳基礎(chǔ)對(duì)于提升育種效果至關(guān)重要[10]。雖然國(guó)內(nèi)日本落葉松種子園群體遺傳多樣性較高，但是與原產(chǎn)地相比(He為0.717～0.795，PIC為0.720)[11]，還有很大的提升空間，從育種區(qū)外或者說(shuō)原產(chǎn)地引進(jìn)優(yōu)良資源補(bǔ)充進(jìn)入育種群體，可以有效提高遺傳多樣性，拓寬遺傳基礎(chǔ)。另外，遺傳多樣性隨著遺傳改良進(jìn)程的變化狀況也是育種者和生產(chǎn)者十分關(guān)注的問(wèn)題，下一步可開(kāi)展相關(guān)研究和探討。