蔡志遠，王纏，郭懷亮，姚寶輝，譚宇塵，蘇軍虎*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學-新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，蘭州730070)

應激是指當機體受到外源有害因子刺激，如溫度、噪音、創(chuàng)傷、疼痛以及生存環(huán)境的變化和環(huán)境污染等因素時，機體所產(chǎn)生的一系列非特異性反應的總和(Selye，1976，1998)。當機體受到內(nèi)外因素的刺激時，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)會被激活，這種刺激來源(應激源)進一步激活機體以藍斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(sympathetic-adrenal-medulla axis，SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)為主的神經(jīng)內(nèi)分泌反應，由此引發(fā)機體全身非特異性應答反應(Herman &Cullinan，1997；Carrasco &Van de Kar，2003)。Mason等(1990)發(fā)現(xiàn)，應激反應的程度不僅與外部環(huán)境的變化有關，也與個體對應激源的認知有密切聯(lián)系，同種應激刺激可能誘發(fā)焦慮應激，也可能導致抑郁性應激。在Selye的基礎上，學者們對應激學說不斷地指正完善，使對應激的研究更加深入(Krantz，1983；Lazarus，1985；尤柯，1990)。

從生物學角度來看，機體在正常生長環(huán)境下處于自我平衡狀態(tài)。當機體偏離正常生存環(huán)境時，受到外源環(huán)境的有害刺激，此種有害因子會與機體的自我平衡狀態(tài)發(fā)生沖突，強烈的刺激或者疼痛會使腎上腺分泌交感素并導致血壓升高(姜春雷，王云霞，2015)。野生動物不同于一般家畜，它們對環(huán)境的敏感程度遠大于人工飼養(yǎng)的動物，當野生動物處在人工飼養(yǎng)條件下時，由于生存環(huán)境發(fā)生劇烈改變，應激源增多，機體應激發(fā)生的幾率增大。自然環(huán)境的變化，如溫度、濕度、生存空間密度，人為干擾，如喂食、噪音等擾動，這些刺激遠大于野生動物所處的自然環(huán)境(李朝軍等，2015；鄭玉瑤，2016)。不論是自然環(huán)境的變化還是人為干擾均加劇了動物應激反應，使其免疫機能下降，行為出現(xiàn)異常，生長發(fā)育嚴重受阻，內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，嚴重時可能死亡(Dashow &Epple，1985；Suomi，1987)。

隨著野生動物實驗動物化的發(fā)展，越來越多的科研機構(gòu)開展了人工飼養(yǎng)繁育野生動物的項目，而在飼養(yǎng)管理的過程中，野生動物的應激反應是人工飼養(yǎng)繁育的一大難點(陶元清，張靜宵，1996；何誠，2006；賀爭鳴，2010)。目前，為預防以及緩解人工飼養(yǎng)條件下野生動物的應激，已有部分人工飼養(yǎng)野生動物抗應激研究的報道(何嵐等，2014；張永賓等，2014)，其中除了在養(yǎng)殖管理以及動物飼料喂食管理等方面能夠在一定程度上減少動物應激，藥物治療在動物抗應激中也起到重要作用(王萬華等，2009)。常規(guī)的藥物治療中，通常以在動物飼料中添加抗應激添加劑作為一種治療手段，在一定程度上能夠提高動物的抗應激能力。而在特殊情況下，野生動物經(jīng)過長時間運輸至新的飼養(yǎng)環(huán)境，強烈的刺激可能導致動物處于自身無法調(diào)節(jié)的應激狀態(tài)，此時可以給動物服用或注射鎮(zhèn)定和安定藥物來降低應激所造成的危害(張永賓等，2015；劉學森，2017)。

高原鼢鼠Eospalaxbaileyi隸屬嚙齒目Rodentia鼴形鼠科Spalacidae鼢鼠亞科Myospalacinae凸顱鼢鼠屬(蘇軍虎等，2015)，廣泛分布于甘肅河西走廊以南的祁連山地、甘南藏族自治州、青海省等地區(qū)(康宇坤等，2018)。高原鼢鼠對于高原自然環(huán)境有很好的適應能力，是青藏高原特有物種之一(樊乃昌，施銀柱，1982)，其長期在地下挖掘、覓食，對于低氧潮濕環(huán)境，形成了很強的適應性(王曉君等，2008)。一方面，高原鼢鼠加劇了天然草地退化和荒漠化進程(鐘文勤，樊乃昌，2002)，鼠害防治迫在眉睫；另一方面，高原鼢鼠對低氧、潮濕環(huán)境的獨特的適應性等，成為生理學、醫(yī)學和生態(tài)學等研究的良好模型(安志芳等，2020)，而新的防控機理的研發(fā)和相關生理、生態(tài)學研究均需要室內(nèi)可控實驗的完成，但高原鼢鼠的室內(nèi)養(yǎng)殖至今仍具極大挑戰(zhàn)。高原鼢鼠對高海拔自然環(huán)境有很強的適應能力，而在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下難以成活，因環(huán)境的劇烈變動對高原鼢鼠來說是致命的。對野生動物來說，生存環(huán)境的變化使其長期處于應激狀態(tài)下，輕者影響或降低動物生產(chǎn)性能，重者導致疾病和死亡(李進軍，2018)，對動物機體及上述各方面造成不可逆的影響，因此動物的存活問題成為實驗中最大的難點。研究發(fā)現(xiàn)，生存環(huán)境的劇變作為一種外源應激，一般伴有強烈的精神刺激，從多方面對機體造成損傷，在眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展中起到重要作用(Gregoryetal.，2011)，野生動物生境的變化會進一步加強機體焦慮的癥狀(張強等，2011)。

為研究應激機體自身是否能夠通過藥物治療從而達到改善焦慮應激程度的目的，本研究采用改變高原鼢鼠生存環(huán)境的方法，迫使其處于一種過度焦慮的應激狀態(tài)，同時采用2種不同類型的抗應激藥物——醋酸奧曲肽和米非司酮對應激機體進行干預，探索高原鼢鼠的應激是否得到改善。已有研究表明，動物處于應激狀態(tài)下會表現(xiàn)出近似人類的行為，并且其機體生理功能出現(xiàn)紊亂，因而動物行為學在應激領域具有重要意義(Wilsonetal.，2015)。應激水平的測定包括一系列生理指標與行為學指標，在生理指標上可參考動物攝食、體質(zhì)量、心率以及應激激素表達量等，行為學測定上以常見的焦慮模型，如高架十字迷宮、曠場實驗、明暗箱及水迷宮實驗為主(徐佳，2012)。本研究采用采食量、體質(zhì)量、心率和激素等生理指標，以及曠場行為來評價高原鼢鼠的應激水平，并首次對2種不同藥物緩解應激的效果進行了比較。旨在探尋2種抗應激藥物對高原鼢鼠應激反應的改善作用，以提高室內(nèi)飼養(yǎng)條件下高原鼢鼠的成活率，為其后續(xù)研究以及資源利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物2019年8—10月，在非繁殖季節(jié)捕捉并篩選出無損傷的高原鼢鼠84只，雌雄各半。實驗動物均來自甘肅省定西市岷縣等地區(qū)(103°41′29″～104°59′23″E，34°07′34″～34°45′45″N)。將活捕的高原鼢鼠用小型哺乳動物運輸籠運送至甘肅農(nóng)業(yè)大學動物飼養(yǎng)室進行人工飼養(yǎng)，將高原鼢鼠放置在長50 cm×寬40 cm×高40 cm帶蓋子的收納箱中(開有透氣孔)，為模擬高原鼢鼠地下生存環(huán)境，箱內(nèi)裝有1/3的干凈土壤和一個直徑8 cm的PVC管，并保證動物飼養(yǎng)室內(nèi)處于完全黑暗狀態(tài)。室溫18～20 ℃，每只高原鼢鼠將被單籠飼養(yǎng)且保證空氣通暢。每日08∶00喂食新鮮紅薯Ipomoeabatatas，喂食量按照每100 g體質(zhì)量給予 30 g。為減少長途運輸以及捕捉行為對高原鼢鼠造成的過度應激，篩選的高原鼢鼠在室內(nèi)環(huán)境下適應2 d后正式開始實驗，之后進行動物行為學及其他生理生化指標的測定，以最大程度減少其他因素對藥物實驗結(jié)果的干擾。

1.1.2 藥物醋酸奧曲肽購自上海源葉生物科技有限公司(批號：P13S8Y43599)，用水溶解為濃度10 μg·mL-1。米非司酮購自上海麥克林生化科技有限公司(批號：C10039007)，用水溶解為濃度10 mg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將高原鼢鼠分為對照組(生理鹽水灌胃)、醋酸奧曲肽組、米非司酮組，每組28只，雌雄各半，每只高原鼢鼠單獨編號?？紤]到野生動物對藥物的耐受程度以及減少人工給藥給動物造成的應激，給藥體積為每100 g體質(zhì)量0.1 mL，采取灌胃的方式間隔給藥，給藥7 d。

1.2.2 生長性能測定以7 d后仍然成活的高原鼢鼠數(shù)據(jù)為準，分別以體質(zhì)量變幅和采食量計算其生長性能。于實驗第1天、第7天稱量各組成活高原鼢鼠的體質(zhì)量，以實驗前后的體質(zhì)量差值計算7 d 后體質(zhì)量變幅。實驗7 d內(nèi)，每天稱量食物重量，同時對隔天的剩余食物進行稱量回收，計算7 d內(nèi)食物攝入總量。

1.2.3 心率測定心率是反映自主神經(jīng)系統(tǒng)功能的一項指標，反映了個體適應壓力的能力，在一定程度上可反映出機體當前所面臨的應激水平(Tanetal.，2011)。心率檢測參考程琪等(2017)和Qu等(2018)的方法，在安靜無噪音的房間內(nèi)進行，使用錄音棒(索尼立體聲數(shù)碼錄音棒，ICD-SX2000)錄制每只高原鼢鼠的心跳聲2 min，數(shù)據(jù)分析時截取穩(wěn)定無雜音的心跳聲15 s，以此計算每分鐘心跳次數(shù)。

1.2.4 行為學測定曠場行為目的在于測試動物在進入陌生環(huán)境的下意識反應，結(jié)合其他行為學等指標，能夠?qū)游锏那榫w狀態(tài)做出評判(Cholerisetal.，2001)。模擬暗光環(huán)境，通過長100 cm×寬100 cm×高40 cm的玻璃曠場實驗箱，實驗箱底部劃分為25個20 cm×20 cm的方格，中央格為箱體中間的9格，余下16格為外周區(qū)域。每組至少 8只以上的健康高原鼢鼠，雌雄各半。實驗開始時輕輕抓住尾巴將其放置在正中央格后，記錄5 min內(nèi)的行為表現(xiàn)，每只動物只進行1次測定。每只測定結(jié)束后，徹底清潔，同時用濃度25%的酒精對實驗箱體內(nèi)外擦拭，以消除其他高原鼢鼠的氣味等(林曉春等，2010；吳曉玲，張貴鋒，2018)。

參考Walsh和Cummins(1976)、Alstott和Timberlake(2009)中曠場實驗行為的研究方法，檢測指標有：中央格停留時間[高原鼢鼠進入曠場實驗箱內(nèi)到第一次離開中央格(中央9格區(qū)域)的時間]、移動格子數(shù)(高原鼢鼠四肢踏入一個格子內(nèi)視為移動1格)、攀爬頻次(高原鼢鼠前爪離地或攀附周壁)、修飾頻次(高原鼢鼠用四肢進行撓癢、舔舐身體等梳理行為)、排便及排尿分值(有尿液記為1分，糞便按照顆粒計數(shù)進行記分)和中央格穿越次數(shù)(從高原鼢鼠第一次離開中央格后再次進入開始計算)。

1.2.5 應激激素測定實驗結(jié)束后，每組6只(雌性3只，雄性3只)供試動物斷頸取血，由于高原鼢鼠在受到威脅的同時具有強烈的攻擊性，考慮到實驗操作人員的安全，以及采血的同時機體受到強烈的刺激會導致血漿激素的變化，血液采集在乙醚麻醉后進行。血清樣本-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(綠葉生物科技有限公司)定量測定高原鼢鼠血清應激激素水平，包括皮質(zhì)酮(CORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。

1.2.6 死亡率統(tǒng)計實驗周期為14 d，參與死亡率統(tǒng)計的為各組全部的28只供試動物，用于采集激素指標處死的動物不計入死亡率。7 d后各組死亡率以前7 d每日意外死亡為準，14 d后各組死亡率以整個實驗周期14 d內(nèi)意外死亡的動物為準。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

給藥7 d后，各組高原鼢鼠的體質(zhì)量均有不同程度下降，但降幅之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1：a)；但2種藥物組體質(zhì)量的降幅均小于對照組。同時，2種藥物組的采食量均高于對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1：b)。

圖1 給藥7 d后各組高原鼢鼠體質(zhì)量(a)和采食量(b)的變化Fig.1 Body mass (a) and feed intake (b) changes of Eospalax baileyi in each group after 7 days of treatment

2.2 心率

給藥7 d后，2種藥物組和對照組的心率之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 曠場實驗行為學測定

給藥7 d后，醋酸奧曲肽組高原鼢鼠中央格停留時間大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；米非司酮組中央格停留時間大于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2：a)。各組高原鼢鼠中央格穿越次數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2：b)。

圖2 給藥7 d后各組高原鼢鼠5 min內(nèi)曠場實驗的中央格停留時間(a)及中央格穿越次數(shù)(b)Fig.2 Comparison of central grid stay time (a) and central grid crossing times (b) of Eospalax baileyi in open field test within 5 min after 7 days of treatment

給藥7 d后，2種藥物組高原鼢鼠移動格子數(shù)均顯著少于對照組(P<0.05)，但2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3：a)。2種藥物組的攀爬頻次也均顯著少于對照組(P<0.05)，但2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3：b)。醋酸奧曲肽組高原鼢鼠的修飾次數(shù)多于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；米非司酮組的多于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3：c)。各組間的排便及排尿分值之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3：d)。

圖3 給藥7 d后各組高原鼢鼠5 min內(nèi)曠場實驗的移動格子數(shù)(a)、攀爬頻次(b)、修飾頻次(c)和排便及排尿分值(d)

2.4 應激激素對比

給藥7 d后，2種藥物組高原鼢鼠的CORT水平均低于對照組，其中，米非司酮組顯著低于對照組(P<0.05)，但2種藥物組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4：a)。醋酸奧曲肽組的ACTH含量與對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但米非司酮組的顯著低于對照組和醋酸奧曲肽組(P<0.05)(圖4：b)。

圖4 給藥7 d后各組高原鼢鼠的皮質(zhì)酮(a)和促腎上腺皮質(zhì)激素(b)Fig.4 Comparison of corticosterone (a) and adrenocorticotropic hormone (b) in different groups of Eospalax baileyi after 7 days of treatment

2.5 死亡率

給藥7 d后，對照組的死亡率與醋酸奧曲肽組一致，14 d后，對照組的死亡率保持較高水平增長，醋酸奧曲肽組死亡率放緩。而米非司酮組的死亡率一直最低(表1)。

表1 給藥7 d后及14 d后各組高原鼢鼠的死亡率Table 1 Mortality rate of Eospalax baileyi after 7 days and 14 days of treatment

3 討論

應激反應是以下丘腦HPA為主的神經(jīng)內(nèi)分泌反應，當動物受到外界環(huán)境變化的刺激時，下丘腦的飽食和饑餓中樞會受到影響，攝食行為受到應激反應的抑制或者腸胃功能出現(xiàn)異常，繼而會導致攝食量減少、體質(zhì)量負增長等，因而動物采食量、體質(zhì)量增減程度對應激的評判具有重要的價值(Scalera &Tarozzi，2001；張月萍，王建軍，2001)。張善超(2010)的研究結(jié)果表明，生存環(huán)境的劇變會使野生動物暴露在應激壓力下，這時機體為了適應環(huán)境變化，體內(nèi)的腎上腺皮質(zhì)激素會過量分泌，加速新陳代謝水平，機體大量分解蛋白質(zhì)、脂肪等，以產(chǎn)生足夠?qū)箲さ哪芰?。本實驗結(jié)果與上述研究一致，這說明2種抗應激藥物在一定程度上緩解了應激對高原鼢鼠生長性能帶來的影響。

本實驗心率測試結(jié)果顯示，給藥前后各組心率之間的差異均無統(tǒng)計學意義，表明藥物還不能影響高原鼢鼠的心率。曠場行為實驗結(jié)果顯示，給藥7 d后，藥物組的中央格停留時間延長，水平運動量下降，這與陳光耀等(2016)和史海霞(2019)的研究結(jié)果不同。環(huán)境改變導致應激是一種慢性的應激刺激，更多的是心理方面造成的創(chuàng)傷。長時間處于應激壓力下，絕大程度會導致機體產(chǎn)生抑郁等不良反應，處于應激狀態(tài)下的動物在曠場實驗中會出現(xiàn)中央格停留時間延長、水平運動量下降等(張強等，2009；宋川，熊正英，2013)。本研究中，隨著應激時間的延長，對照組的中央格停留時間縮短、水平運動量上升，可能是因為不同于常規(guī)的實驗動物(大鼠Rattusnorvegicus或小鼠Musmusculus)，高原鼢鼠是一種野生鼠，并且長期營地下生活，生存環(huán)境變化與人為擾動更易使其產(chǎn)生焦慮樣行為，這與高博(2015)的研究結(jié)果一致。藥物組的攀爬頻次顯著小于對照組，這與劉文俊等(2017)的研究結(jié)果相似。修飾行為是動物處于放松狀態(tài)的一種行為表現(xiàn)，在動物應激實驗中也是作為測定應激水平的一種重要參考(王振龍，劉季科，2002)。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物組的修飾頻次顯著多于對照組，這與吳紅芳等(2018)的研究結(jié)果一致。值得注意的是，由于高原鼢鼠的活動特征不同于地上鼠類，常年的地下生活使高原鼢鼠視力退化(戴月琴，2007)，如測試以明暗箱為例，由于高原鼢鼠趨暗的特性，會使其趨向于停留在暗箱內(nèi)，但本研究參考了行為實驗中的饑餓刺激法避免了該現(xiàn)象的發(fā)生。

動物受到外界有害因子刺激時，應激源刺激信息會通過下丘腦合成促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，CRH是HPA激活的關鍵，也能增強HPA的活動。CRH主要作用于垂體前葉的促腎上腺皮質(zhì)激素細胞并促進機體分泌ACTH(Monclúsetal.，2009)，ACTH能夠激活腎上腺皮質(zhì)細胞合成并釋放糖皮質(zhì)激素(GC)，GC對HPA有負反饋調(diào)節(jié)機制，高水平的GC與糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合，通過一定的途徑抑制HPA的過度反應，從而調(diào)節(jié)機體能量分配和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對機體適應有害因子刺激起重要作用(Tsigos &Chrousos，2002)，而血液應激激素的變化對應激領域的研究具有重要意義(Maier &Watkins，1998)。本研究中，給藥7 d后，2種藥物組血清的ACTH含量均低于對照組，而對照組高水平ACTH表達無法自身緩解，免疫力以及對環(huán)境的適應能力減弱，采食量顯著減少并出現(xiàn)大量死亡，而2種藥物能有效緩解上述不良反應，這與Karalis等(1997)的研究結(jié)果一致。適量的GC能夠有效提高機體的適應能力，但GC分泌過高時，過量的GC會使得HPA的負反饋調(diào)節(jié)機制失衡，對機體免疫系統(tǒng)造成極大的損害，如生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)力下降等(姜龍，2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，給藥7 d后，米非司酮組血清中的CORT含量顯著低于對照組，體質(zhì)量降幅水平明顯低于對照組，7 d 和14 d的死亡率最低。這也說明，由于過度應激導致CORT含量的變化會顯著影響到高原鼢鼠的生長發(fā)育和生理狀態(tài)，外在行為表現(xiàn)也會發(fā)生相應改變，這與蘭玲(2005)的研究結(jié)果一致。

綜上所述，醋酸奧曲肽、米非司酮在本次實驗中均有效地緩解了高原鼢鼠的應激行為，提高了其采食量，但結(jié)合7 d和14 d的死亡率、應激激素含量，米非司酮能更有效緩解高原鼢鼠的應激狀況，對提高其成活率有重要作用。