樸弋戈，劉楊，唐業(yè)忠，陳勤*

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

1938年，美國心理學(xué)家斯金納總結(jié)并提出了“操作性條件反射”(Skinner，1938)。操作性條件反射是通過將自發(fā)行為受刺激強(qiáng)化影響而與刺激相聯(lián)系，在正性獎(jiǎng)勵(lì)與負(fù)性懲罰的作用下，引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)個(gè)體完成特定行為，是動(dòng)物行為、認(rèn)知研究中的經(jīng)典訓(xùn)練方法，在模式動(dòng)物中產(chǎn)生了豐富的研究成果(Huston &Borbely，1973；Wengeretal.，2004；Brembs，2011；Valenteetal.，2012)。爬行類、鳥類與哺乳類共享一些基本生理與行為特征，又因中樞神經(jīng)的結(jié)構(gòu)差異，具有認(rèn)知能力的差別(Macphail，1982)。目前，多數(shù)認(rèn)知研究僅在鳥類與哺乳類中開展，較少涉及爬行類。隨著認(rèn)知科學(xué)的發(fā)展，對(duì)于爬行類的認(rèn)知研究亦開始起步(Vonk &Shackelford，2012；Wilkinson &Huber，2012；Matsubaraetal.，2017)。然而，爬行類中學(xué)習(xí)行為研究取得的發(fā)展仍較有限，且多集中于紅腿陸龜Geochelonecarbonaria、納爾遜偽龜Pseudemysnelsoni等少數(shù)物種或類群(Wilkinson &Huber，2012)。因此，該領(lǐng)域亟待探究更多的物種，在更大的分類尺度上比較多種爬行動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力(Matsubaraetal.，2017)。

蛇類作為爬行綱Reptilia中種類數(shù)量最豐富、分布最廣泛的類群之一(Kerkkampetal.，2017)，在生物學(xué)及諸多交叉領(lǐng)域都有重要的研究價(jià)值(Grachevaetal.，2010；Lillywhite，2014；Botheetal.，2019)。蛇類的學(xué)習(xí)行為研究亦取得了一定的進(jìn)展(Holtzmanetal.，1999；Stoneetal.，2000；Place，2005；Burghardt，2013；Emeretal.，2015；Friesen，2017)，但仍限于少數(shù)物種，且較少涉及蝮亞科Crotalinae蛇類。蝮亞科蛇類具有高度靈敏的頰窩器官，可接收環(huán)境中的紅外信息(Noble &Schmidt，1937；Bullock &Cowles，1952)，與經(jīng)視覺感官接收的光學(xué)信息一起形成獨(dú)特的“視覺”(Goris，2011)。獨(dú)特的信息輸入增強(qiáng)了蝮蛇對(duì)環(huán)境的感知能力(Kardong &Mackessy，1991；Embaretal.，2018)；但額外輸入的信息是否影響蝮蛇的行為決策，與其他蛇類或有鱗類相比，學(xué)習(xí)等認(rèn)知能力是否存在區(qū)別尚不明確。

參考有鱗目Squamata學(xué)習(xí)行為的既有研究，本研究使用Y迷宮作為實(shí)驗(yàn)裝置，采用既有研究中曾使用的3種懲罰刺激，以短尾蝮Gloydiusbrevicaudus進(jìn)行操作性條件反射訓(xùn)練?；贛atsubara等(2017)的研究思路，使用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探究其他類群(蝮亞科)的學(xué)習(xí)行為，為在更大的分類尺度上進(jìn)行比較研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

短尾蝮是我國廣泛分布的一種蝮亞科蛇類(趙爾宓，2006)，個(gè)體相對(duì)較小，在蝮蛇行為學(xué)研究中可操作性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選取10條實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的短尾蝮，包括3條雄性和7條雌性(表1)。受進(jìn)食、蛻皮等情況影響，所有實(shí)驗(yàn)均僅選取其中部分個(gè)體參與。

表1 樣本形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)Table 1 Morphological measurement of the specimens

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均單獨(dú)飼養(yǎng)于飼養(yǎng)箱(長32 cm×寬22 cm×高19 cm)中。飼養(yǎng)箱內(nèi)以報(bào)紙作為墊料，放置一水盆供蛇自由飲用，同時(shí)提供爬蟲躲避穴(長23 cm×寬16.5 cm×高7.5 cm)供蛇隱藏。飼養(yǎng)房內(nèi)溫度設(shè)定為25 ℃。光周期設(shè)定為12 h∶12 h，光照時(shí)間為08∶00—20∶00。使用實(shí)驗(yàn)小鼠以1周1次喂食，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間不提供食物。實(shí)驗(yàn)前遮蔽蛇的雙眼，使用1層醫(yī)用膠布后覆蓋1層黑色膠布，適應(yīng)24 h以上。若蛇已進(jìn)食，則至少2 d后再進(jìn)行遮蔽。若蛇臨近蛻皮，則該個(gè)體不參與實(shí)驗(yàn)，待其蛻皮完成后進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

基礎(chǔ)Y迷宮使用厚度3 mm黑色亞克力材料制成。迷宮各部分均為長方體，主體尺寸為長30 cm×寬20 cm×高15 cm，兩臂尺寸均為長30 cm×寬11 cm×高15 cm，與主體部分相連，夾角約50°。以金屬網(wǎng)(長20 cm×寬15 cm，孔徑5 mm×5 mm)(Manjarrez &Vacaleón，2018)將主體部分分為適應(yīng)區(qū)(20 cm×20 cm)和選擇區(qū)(20 cm×10 cm)(圖1)。使用規(guī)格為1 cm×1 cm的正方形白色電熱陶瓷片(XH-RP1010；江蘇星河電子科技，江蘇宿遷)組裝成2個(gè)圖形(圖2)，作為兩側(cè)迷宮臂的指示物。圖形均使用20個(gè)陶瓷片串聯(lián)拼裝，保證圖形發(fā)熱面積一致。實(shí)驗(yàn)過程中，2個(gè)圖形串聯(lián)通電30 V，擺放于迷宮臂盡頭，呈現(xiàn)紅外信息輔助蝮蛇進(jìn)行定位、學(xué)習(xí)。指定“”圖形所在一側(cè)的迷宮臂為安全區(qū)(無懲罰刺激)，“+”圖形所在一側(cè)的迷宮臂為懲罰區(qū)。實(shí)驗(yàn)中迷宮擺放朝向、圖形位置與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)順序均隨機(jī)。實(shí)驗(yàn)間隔期間使用肥皂水擦拭整個(gè)迷宮并吹干，以減少殘留氣味因素的干擾。

圖1 Y迷宮裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of Y-maze

圖2 指示圖形Fig.2 Indicating shapes

1.3 實(shí)驗(yàn)刺激

蛇類進(jìn)食頻率低、耐饑餓能力強(qiáng)，以食物作為獎(jiǎng)勵(lì)難以維持實(shí)驗(yàn)定量、定期進(jìn)行(Kellogg &Pomeroy，1936；Wilkinson &Huber，2012)。此外，蝮蛇作為典型的伏擊型捕食者，常長時(shí)間蜷縮一處(Clark，2016)，游走性較差，故主要使用懲罰刺激驅(qū)使其離開迷宮起始區(qū)而進(jìn)入迷宮兩臂。

1.3.1 水刺激盡管許多蛇類可入水游泳(趙爾宓，2006)，但多數(shù)蛇類仍積極離開水體。先前研究中使用半水棲型平原束帶蛇Thamnophisradix與水棲型南部水蛇Nerodiafasciata的水迷宮實(shí)驗(yàn)均取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Kellogg &Pomeroy，1936；Fuenzalida &Ulrich，1975)。

第一組實(shí)驗(yàn)中，迷宮傾斜5°擺放，主體位于斜面下方，兩臂位于斜面上方。迷宮底部墊以砂紙，增大摩擦力以輔助蛇爬行。于適應(yīng)區(qū)頂部開一小孔(直徑4 mm)，以塑料軟管連接至水槽。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將短尾蝮引入適應(yīng)區(qū)后關(guān)閉金屬網(wǎng)，待其適應(yīng)10 min。適應(yīng)結(jié)束后，打開金屬網(wǎng)，計(jì)時(shí)10 min，允許蛇自由爬行。若計(jì)時(shí)3 min蛇仍未離開適應(yīng)區(qū)，則將水流自適應(yīng)區(qū)頂部小孔注入，待水淹沒至迷宮兩臂分叉處后停止注水。該水位迫使蛇離開淹沒的適應(yīng)區(qū)，向干燥的斜面上方(即迷宮兩臂)爬行。以蛇身體前段三分之一進(jìn)入某一側(cè)迷宮臂判斷為其進(jìn)入該側(cè)。若蛇進(jìn)入懲罰區(qū)，則用金屬蛇鉤以3 s/次頻率輕壓其頭部(Morietal.，2016)迫使其離開。若蛇進(jìn)入安全區(qū)，則計(jì)時(shí)停止，記錄其逃出時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。若實(shí)驗(yàn)計(jì)時(shí)滿10 min蛇仍未進(jìn)入安全區(qū)，則使用蛇鉤小心將蛇引入安全區(qū)，該時(shí)間記錄為10 min。

第二組實(shí)驗(yàn)中，迷宮擺放于平面，內(nèi)部注水，水深12 cm。同時(shí)撤去金屬網(wǎng)，使用尺寸略小于適應(yīng)區(qū)的一金屬網(wǎng)籠(長20 cm×寬19 cm×高11 cm，孔徑5 mm×5 mm)懸掛于適應(yīng)區(qū)水面上方。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將短尾蝮引入金屬網(wǎng)籠，待其適應(yīng)5 min后，將金屬網(wǎng)籠沉入水中，打開網(wǎng)籠計(jì)時(shí)，允許蛇自由游動(dòng)，尋找離開水體的出口。懲罰區(qū)出口封閉，無法逃出；安全區(qū)出口開放，可以逃出。待蛇經(jīng)出口爬出時(shí)計(jì)時(shí)停止，記錄其逃出時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。若實(shí)驗(yàn)計(jì)時(shí)滿5 min蛇仍未逃出，則使用木棒將蛇引入出口，該時(shí)間記錄為5 min。

每條蛇每天進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔20 min(Fuenzalida &Ulrich，1975)。

1.3.2 高溫刺激已有研究顯示頰窩對(duì)蝮蛇的體溫調(diào)節(jié)具有意義，保留頰窩的蝮亞科蛇類均可準(zhǔn)確進(jìn)入低溫躲避處，遮蔽頰窩的蝮亞科蛇類或無頰窩的其他蝰科Viperidae蛇類則無法完成這一行為(Krochmal &Bakken，2003；Krochmaletal.，2004)。本實(shí)驗(yàn)借鑒Krochmal和Bakken(2003)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以高溫作為懲罰刺激，Y迷宮主體部分加熱、維持溫度高于40 ℃(該溫度為蝮亞科蛇類的脅迫溫度)，迫使蛇尋找出口逃離。

本實(shí)驗(yàn)使用加熱墊置于基礎(chǔ)迷宮主體下方，持續(xù)通電提供高溫刺激(圖3)，迷宮兩臂不作加熱處理。Y迷宮上方覆以一透明打孔亞克力板防止蛇逃逸。該板厚1 cm，尺寸60 cm×60 cm，打孔排列為28×28(行×列)，孔內(nèi)徑9 mm，相鄰兩孔邊緣間距為1 cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將蛇引入適應(yīng)區(qū)，適應(yīng)1 min后，打開金屬網(wǎng)并開始計(jì)時(shí)，任其自然爬行。以蛇身體前段三分之一進(jìn)入迷宮兩臂之一判斷為進(jìn)入該側(cè)。若蛇進(jìn)入安全區(qū)，停止計(jì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。若蛇進(jìn)入懲罰區(qū)，則以木棒經(jīng)上方亞克力板的小孔穿入，輕敲其頭部，直至迫使其離開該側(cè)。實(shí)驗(yàn)以10 min內(nèi)蛇進(jìn)入安全區(qū)為止，記錄該時(shí)間。若超過10 min，蛇仍未進(jìn)入安全區(qū)，則用木棒輕觸蛇，引導(dǎo)其進(jìn)入，該時(shí)間記錄為10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，蛇停留于安全區(qū)10 min以降低體溫。

圖3 加熱Y迷宮裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of the heating Y-maze

每條蛇每天進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔1 h(Holtzmanetal.，1999；Stoneetal.，2000；Friesen，2017)。

1.3.3 輕敲刺激使用輕觸或輕敲的方法在一些蜥蜴的學(xué)習(xí)行為探究中是一種較為成熟的方法(Amiel &Shine，2012；Sunetal.，2014；Chungetal.，2017；Dayananda &Webb，2017；Kangetal.，2018)。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試給予輕敲刺激迫使短尾蝮逃離適應(yīng)區(qū)，Y迷宮中僅安全區(qū)可免于該懲罰刺激，以訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)逃入安全區(qū)。每6次實(shí)驗(yàn)為一組，設(shè)定學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)為：在一組連續(xù)6次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)5次首次選擇正確(Chungetal.，2017；Kangetal.，2018)，達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物被認(rèn)為基本學(xué)會(huì)持續(xù)逃入安全區(qū)域。

參考Lemaster和Mason(2001)將Y迷宮修改為無墻迷宮。撤除迷宮全部垂直面，僅保留原迷宮底面。迷宮放置于金屬支架上，抬高距離地面60 cm，以防止實(shí)驗(yàn)過程中蛇爬下迷宮。同時(shí)，使用雙層黑色塑料袋和金屬框架制作一個(gè)矩形圍帳(長72 cm×寬70 cm×高70 cm)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將抬高的迷宮置于其中以減少外界環(huán)境的干擾。使用熱熔膠固定32支塑料短管垂直于迷宮底面，為蛇提供爬行的支點(diǎn)。塑料管直徑1 cm、高2 cm，排成1列，塑料管間隔2.5 cm(圖4)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將短尾蝮置于迷宮上，使用一金屬網(wǎng)籠(長15 cm×寬10 cm×高11 cm，孔徑5 mm×5 mm)將蛇罩住，待其適應(yīng)5 min。適應(yīng)結(jié)束后，提起金屬網(wǎng)籠，允許蛇自由爬行，計(jì)時(shí)10 min。蛇在爬動(dòng)過程中不給予刺激；若蛇連續(xù)15 s未發(fā)生運(yùn)動(dòng)，則給予輕敲刺激。使用木棒以1 s/次的頻率輕敲蛇的尾基部(泄殖腔背側(cè))，直至其開始運(yùn)動(dòng)。以蛇身體前段三分之一進(jìn)入迷宮臂某一側(cè)判斷為其進(jìn)入該側(cè)。若蛇進(jìn)入懲罰區(qū)，則以木棒輕敲其頭部迫使其離開。若蛇進(jìn)入安全區(qū)，計(jì)時(shí)停止，記錄其逃出時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。若10 min后蛇仍未進(jìn)入安全區(qū)，則使用蛇鉤將蛇輕輕引入安全區(qū)域，該時(shí)間記錄為10 min。

圖4 無墻Y迷宮裝置示意圖(A)與實(shí)物圖(B)Fig.4 Schematic diagram (A) and photo (B) of the wall-less Y-maze

每條蛇每天進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔1 h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

水刺激與高溫刺激實(shí)驗(yàn)以選擇正確率與隨機(jī)選擇(50%)存在顯著差異為標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物判斷為基本習(xí)得訓(xùn)練行為。

2.1 水刺激

第一組實(shí)驗(yàn)使用2號(hào)、3號(hào)與5號(hào)共3條個(gè)體，進(jìn)行8 d共計(jì)115次有效訓(xùn)練。其中，2號(hào)個(gè)體在第8天實(shí)驗(yàn)開始前受外傷，僅有7 d實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3條個(gè)體在訓(xùn)練過程中表現(xiàn)出差異化的行為，但均未達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)；其選擇正確率與逃出時(shí)間見圖5。

圖5 第一組水刺激實(shí)驗(yàn)選擇正確率(A)與逃出時(shí)間(B)Fig.5 Choice accuracy (A) and escape time (B) in the water stimulation experiment 1

2號(hào)個(gè)體正確率始終未達(dá)到隨機(jī)水平(50%)，其逃出時(shí)間也最長。實(shí)際在7 d共35次實(shí)驗(yàn)內(nèi)，該個(gè)體在24次實(shí)驗(yàn)中停留于適應(yīng)區(qū)水體，未表現(xiàn)出明顯移動(dòng)。3號(hào)個(gè)體選擇正確率在8 d 實(shí)驗(yàn)內(nèi)5次高于50%，但與隨機(jī)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其逃出時(shí)間在8 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)未見明顯變化(P>0.05)。5號(hào)個(gè)體選擇正確率在第4天、第5天與第6天逐步提高，但隨后降低，正確率與隨機(jī)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其逃出時(shí)間在8 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)無顯著變化(P>0.05)。

第二組實(shí)驗(yàn)使用3號(hào)與4號(hào)共2條個(gè)體，進(jìn)行9 d共88次有效訓(xùn)練，但2條個(gè)體均未達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)。個(gè)體選擇正確率與逃出時(shí)間見圖6。

圖6 第二組水刺激實(shí)驗(yàn)選擇正確率(A)與逃出時(shí)間(B)Fig.6 Choice accuracy (A) and escape time (B) in the water stimulation experiment 2

3號(hào)個(gè)體選擇正確率在前6 d實(shí)驗(yàn)中逐步提高，隨后降低至低于隨機(jī)水平，其正確率與隨機(jī)選擇差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；該個(gè)體逃出時(shí)間在前4 d實(shí)驗(yàn)中逐漸縮短，但隨后恢復(fù)至較長時(shí)間，在8 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)未見明顯變化(P>0.05)。4號(hào)個(gè)體選擇正確率總體仍低于50%，與隨機(jī)水平間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其逃出時(shí)間在 8 d 實(shí)驗(yàn)內(nèi)未表現(xiàn)出顯著變化(P>0.05)。

2.2 高溫刺激

實(shí)驗(yàn)一共分為3期進(jìn)行。第一期實(shí)驗(yàn)使用3號(hào)、4號(hào)個(gè)體，進(jìn)行5 d共計(jì)34次有效實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)個(gè)體未表現(xiàn)出習(xí)得訓(xùn)練行為，其選擇正確率與逃出時(shí)間見圖7。

圖7 高溫刺激第一期實(shí)驗(yàn)選擇正確率(A)與逃出時(shí)間(B)Fig.7 Choice accuracy (A) and escape time (B) in the high temperature experiment 1

3號(hào)個(gè)體選擇正確率在前3 d實(shí)驗(yàn)中維持在較低水平，后稍有增長，但總體與隨機(jī)水平(50%)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其逃出時(shí)間在5 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4號(hào)個(gè)體選擇正確率始終低于50%，其逃出時(shí)間在實(shí)驗(yàn)過程中未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

第二期實(shí)驗(yàn)使用1號(hào)、5號(hào)個(gè)體，進(jìn)行9 d共計(jì)75次有效實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)個(gè)體未表現(xiàn)出習(xí)得訓(xùn)練行為，其選擇正確率與逃出時(shí)間見圖8。

圖8 高溫刺激第二期實(shí)驗(yàn)選擇正確率(A)與逃出時(shí)間(B)Fig.8 Choice accuracy (A) and escape time (B) in the high temperature experiment 2

1號(hào)與5號(hào)個(gè)體的選擇正確率于隨機(jī)水平(50%)上持續(xù)波動(dòng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3號(hào)與5號(hào)個(gè)體的逃出時(shí)間在9 d的實(shí)驗(yàn)過程中未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

綜合前2期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，第三期實(shí)驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長至20 min。使用6號(hào)、7號(hào)與10號(hào)個(gè)體，進(jìn)行5 d共計(jì)56次有效訓(xùn)練，除6號(hào)個(gè)體外，其他實(shí)驗(yàn)個(gè)體未達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)，其選擇正確率與逃出時(shí)間見圖9。

圖9 高溫刺激第三期實(shí)驗(yàn)選擇正確率(A)與逃出時(shí)間(B)Fig.9 Choice accuracy (A) and escape time (B) in the high temperature experiment 3

6號(hào)個(gè)體選擇正確圖形的次數(shù)顯著高于隨機(jī)水平(50%)(P=0.012)，但成功率隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加呈下降趨勢(shì)，其逃出時(shí)間總體呈增加趨勢(shì)，但隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。7號(hào)個(gè)體的選擇成功率略呈下降趨勢(shì)，與隨機(jī)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，逃出時(shí)間在5 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10號(hào)個(gè)體選擇正確率與隨機(jī)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，逃出時(shí)間在實(shí)驗(yàn)過程中無顯著變化(P>0.05)。

2.3 輕敲刺激

無墻迷宮實(shí)驗(yàn)使用6～10號(hào)共5條個(gè)體，進(jìn)行5 d共計(jì)91次有效實(shí)驗(yàn)，逃出時(shí)間見圖10。

圖10 無墻迷宮實(shí)驗(yàn)逃出時(shí)間Fig.10 Escape time in the wall-less Y-maze experiments

在5 d實(shí)驗(yàn)中，全部實(shí)驗(yàn)個(gè)體均未達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)；多數(shù)個(gè)體在每天4次實(shí)驗(yàn)中正確、錯(cuò)誤選擇各2次，即為隨機(jī)選擇(50%)。在連續(xù)實(shí)驗(yàn)中，盡管9號(hào)個(gè)體逃出時(shí)間明顯縮短，7號(hào)、10號(hào)個(gè)體的逃出時(shí)間也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但全部個(gè)體逃出時(shí)間在5 d實(shí)驗(yàn)內(nèi)均未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用水、高溫和輕敲作為懲罰刺激，驅(qū)使短尾蝮離開適應(yīng)區(qū)、進(jìn)入迷宮安全區(qū)一側(cè)逃離懲罰刺激，以此訓(xùn)練短尾蝮學(xué)習(xí)識(shí)別安全區(qū)信號(hào)的行為。3個(gè)不同刺激的實(shí)驗(yàn)中，盡管部分個(gè)體在短期內(nèi)曾表現(xiàn)出選擇正確率上升和逃出時(shí)間縮短的現(xiàn)象，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上未表現(xiàn)出習(xí)得訓(xùn)練行為。

3.1 水刺激

習(xí)慣化是動(dòng)物在重復(fù)刺激下對(duì)該刺激行為反應(yīng)降低的現(xiàn)象，是一種基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)形式(Harris，1943)，在動(dòng)物界極為常見，蛇類的行為學(xué)研究中亦有發(fā)現(xiàn)(Glaudas，2004；Place，2005；Place &Abramson，2008)。水刺激懲罰實(shí)驗(yàn)說明，這一強(qiáng)度較低的刺激難以長時(shí)間維持，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物很快表現(xiàn)出對(duì)水環(huán)境的適應(yīng)性，不再積極逃離，無法持續(xù)進(jìn)行條件反射訓(xùn)練。水刺激懲罰實(shí)驗(yàn)中，可見短尾蝮停留、浸泡于水體中的現(xiàn)象。在第一組115次實(shí)驗(yàn)中，共計(jì)32次觀察到該現(xiàn)象，其中24次存在于2號(hào)個(gè)體，該個(gè)體明顯較適應(yīng)水環(huán)境。3號(hào)和5號(hào)個(gè)體的不逃離行為共發(fā)生8次，其中3次均發(fā)生于第2天實(shí)驗(yàn)，另外5次集中于最后3 d實(shí)驗(yàn)。這種行為導(dǎo)致3號(hào)和5號(hào)個(gè)體的選擇正確率下降與逃出時(shí)間延長，表明蛇已逐步適應(yīng)水刺激，不再傾向于移動(dòng)、躲避。第二組實(shí)驗(yàn)顯著增加了注水量，主要參考平原束帶蛇的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與步驟，但仍未能觀察到短尾蝮的學(xué)習(xí)跡象。第二組共計(jì)88次實(shí)驗(yàn)，33次蛇停留于水體中的時(shí)間超過實(shí)驗(yàn)時(shí)間，其中19次發(fā)生于最后4 d實(shí)驗(yàn)中。這一現(xiàn)象同第一組實(shí)驗(yàn)一致，表示蛇對(duì)水刺激已逐漸適應(yīng)，不再積極逃離水體。

3.2 高溫刺激

實(shí)驗(yàn)過程中部分個(gè)體存在明顯的趨觸性行為，即蛇的身體緊靠垂直面、沿迷宮壁爬行；這一行為在多數(shù)蛇類中均可觀察到(Ford &O’Bleness，1986；Costanzo，1989；Greeneetal.，2001)。趨觸性行為顯著混淆了實(shí)驗(yàn)結(jié)果：短尾蝮并非主動(dòng)選擇進(jìn)入某一側(cè)，其選擇取決于首先接觸的迷宮壁，隨后則沿壁爬行被動(dòng)進(jìn)入對(duì)應(yīng)一側(cè)迷宮臂。因此，蛇類Y迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意考慮消除趨觸性的影響。高溫刺激懲罰實(shí)驗(yàn)中，第三期實(shí)驗(yàn)中的6號(hào)個(gè)體選擇正確的次數(shù)顯著高于隨機(jī)水平，然而該個(gè)體并非學(xué)會(huì)了持續(xù)進(jìn)入安全區(qū)。在未經(jīng)訓(xùn)練的第1天實(shí)驗(yàn)中，6號(hào)個(gè)體表現(xiàn)出100%的正確率，并在第2天實(shí)驗(yàn)中維持了這一正確率。盡管圖形位置為隨機(jī)決定，實(shí)際在該個(gè)體前2 d(共8次)的實(shí)驗(yàn)中，7次實(shí)驗(yàn)內(nèi)安全區(qū)位于右側(cè)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的12次空白實(shí)驗(yàn)中，6號(hào)個(gè)體并未表現(xiàn)出顯著的方向偏好性。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，該個(gè)體的正確率逐步下降；同時(shí)，其逃出時(shí)間反而逐步上升。以上數(shù)據(jù)說明，6號(hào)個(gè)體的較高正確率可能僅為小概率事件。

實(shí)驗(yàn)過程中，高溫刺激對(duì)短尾蝮的驅(qū)避作用并不明顯。第一期和第二期實(shí)驗(yàn)共109次實(shí)驗(yàn)中，存在23次蛇停留不動(dòng)、直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的情況。在第三期實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長至20 min；但在共計(jì)56次實(shí)驗(yàn)中，仍存在15次相同的情況。部分個(gè)體明顯更耐熱，3號(hào)、4號(hào)與7號(hào)個(gè)體可忍受加熱時(shí)間達(dá)25 min而無明顯行動(dòng)。這一現(xiàn)象在以往研究中亦存在(Krochmal &Bakken，2003；Krochmaletal.，2004)；為解決這一問題，Krochmal等(2004)將迷宮溫度進(jìn)一步升高至45 ℃甚至50 ℃以迫使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逃離迷宮。本實(shí)驗(yàn)也嘗試了這種方法。當(dāng)短尾蝮置于迷宮中體溫升高至較高溫度時(shí)，可觀察到其呼吸頻率顯著增高(Seebacher &Franklin，2005)。隨后蛇產(chǎn)生“驚恐式”竄逃行為，表現(xiàn)為身體顫動(dòng)、急速而無序地爬行。此時(shí)，若蛇進(jìn)入懲罰區(qū)域，即使給予其高頻率(1 s/次)輕敲頭部的懲罰亦不能迫使其返回溫度較高的迷宮主體部分；該狀態(tài)下蛇對(duì)致死溫度的躲避行為已不具備條件反射訓(xùn)練的可行性。

3.3 輕敲刺激

相較于水刺激與高溫刺激實(shí)驗(yàn)，輕敲刺激實(shí)驗(yàn)有效避免了趨觸性。逃出時(shí)間顯著縮短，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)在5 min內(nèi)完成；表明輕敲刺激強(qiáng)度較高，短尾蝮對(duì)該刺激存在明顯逃避行為。在實(shí)驗(yàn)過程中可觀察到蛇面對(duì)木棒敲擊時(shí)表現(xiàn)出較激烈的反應(yīng)，其典型行為為蛇的頭部朝向木棒嘗試攻擊，同時(shí)身體蜷縮、倒退進(jìn)入某一側(cè)迷宮臂。91次實(shí)驗(yàn)中，記錄到6次因試圖躲避刺激時(shí)竄逃而摔下迷宮的現(xiàn)象，同時(shí)存在約10次撲咬木棒的行為。

3.4 懲罰刺激缺陷

綜合全部實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象體現(xiàn)出單一懲罰刺激的缺陷。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，需要有效刺激驅(qū)使蛇離開起始區(qū)域，并作為懲罰區(qū)域?qū)?yīng)的懲罰。在一系列先前研究曾使用或本研究嘗試使用的懲罰刺激中，構(gòu)成了由弱到強(qiáng)漸變的多種刺激。然而，對(duì)于強(qiáng)度較低的弱刺激，如強(qiáng)光(預(yù)實(shí)驗(yàn)中嘗試使用)、水(水刺激懲罰實(shí)驗(yàn))、振動(dòng)(Crawford &Holmes，1966)等，蛇表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)性(即習(xí)慣化)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)天后蛇對(duì)于該刺激的行為反應(yīng)弱化甚至不再逃避。對(duì)于強(qiáng)度較高的刺激，如電擊(Wolfle &Brown，1940；Mills，1970)、輕敲刺激等，蛇行為反應(yīng)過激，突然竄逃、掙扎、撲咬的現(xiàn)象持續(xù)存在，不利于條件反射的訓(xùn)練。加熱刺激雖是較為合適的中強(qiáng)度刺激，但具有時(shí)間累計(jì)效應(yīng)的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中短尾蝮表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐熱能力，延長了加熱時(shí)間，失去了訓(xùn)練的可行性。

短尾蝮在相似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下的學(xué)習(xí)表現(xiàn)弱于先前研究中的平原束帶蛇、西部菱背響尾蛇Crotalusatrox、彩虹石龍子Lampropholisdelicata等動(dòng)物(Fuenzalida &Ulrich，1975；Krochmal &Bakken，2003；Chungetal.，2017)。爬行動(dòng)物類群中，蛇類與蜥蜴具有一定的學(xué)習(xí)能力，但認(rèn)知能力弱于龜鱉類與鱷類(Northcutt，2013)。因此，可能原因之一為安全區(qū)位置的隨機(jī)變換增加了學(xué)習(xí)難度。實(shí)驗(yàn)中刺激亦可能影響了動(dòng)物的本能反應(yīng)。短尾蝮雖是地棲型蝮蛇，但自然環(huán)境中存在降雨等水刺激，因此持續(xù)使用水刺激時(shí)，蛇可逐步對(duì)刺激形成習(xí)慣化。蝮蛇為變溫動(dòng)物，體溫隨環(huán)境溫度波動(dòng)。使用加熱刺激時(shí)，刺激初期蛇體溫較低，其本能行為可能更傾向于停留原處、升高體溫，由此延長了加熱時(shí)間，直至體溫過熱引起竄逃行為。在無墻迷宮實(shí)驗(yàn)中，因刺激強(qiáng)度較高，持續(xù)刺激時(shí)蛇的本能可能由逃離轉(zhuǎn)為防御性攻擊行為。在攻擊行為中，短尾蝮頭部朝向木棒，已無法觀察身后迷宮臂是否為安全區(qū)域，不利于學(xué)習(xí)訓(xùn)練。

綜上，由實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可見短尾蝮表現(xiàn)出“低敏感度、高耐受性”的特點(diǎn)。懲罰實(shí)驗(yàn)效果提示，在動(dòng)物條件反射訓(xùn)練中，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)符合動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)即時(shí)環(huán)境中的自然行為(即時(shí)本能)(Place，2005)。建議在未來的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，多使用其自然行為作為動(dòng)物認(rèn)知能力的判斷依據(jù)。

致謝：感謝日本京都大學(xué)福田將矢博士與中國科學(xué)院成都生物研究所孫曉倩同學(xué)在實(shí)驗(yàn)操作過程中給予的幫助，感謝中國科學(xué)院成都生物研究所兩棲爬行動(dòng)物研究室各位老師在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、修改過程中提供的指導(dǎo)。