吳晨燕，楊 梅，梁麗雅，馬儷珍,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市強(qiáng)源食品有限公司，天津 301700）

傳統(tǒng)牛肉調(diào)味料以牛骨肉末為原料，經(jīng)高壓浸提、酶解、美拉德反應(yīng)制成，是天然熱反應(yīng)肉味香精的一種[1]。發(fā)酵牛肉調(diào)味料（Fermented Beef Flavorings,FBF）以傳統(tǒng)制作工藝為基礎(chǔ)，在酶解和美拉德反應(yīng)中間增加發(fā)酵環(huán)節(jié)制作而成[2]，發(fā)酵處理能提高牛肉調(diào)味料的風(fēng)味[3]，且終產(chǎn)物有很好的抑菌性[4]。發(fā)酵時間和發(fā)酵劑種類的差異會影響終產(chǎn)物的形成。馬藝熒等[5]研究東北酸菜發(fā)酵時間對有機(jī)酸含量影響時發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間延長，有機(jī)酸含量明顯增加。王赫等[6]在研究發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵飼料中的主要營養(yǎng)物質(zhì)含量影響時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間與飼料中的粗蛋白、氨基酸、蛋氨酸、乳酸菌活菌數(shù)、乳酸含量等均呈二次曲線關(guān)系，適宜的發(fā)酵時間會促進(jìn)飼料中營養(yǎng)物質(zhì)、乳酸菌、乳酸量的增加。陳忠軍等[7]研究乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件時發(fā)現(xiàn)，乳桿菌在發(fā)酵24 h 時抑菌活性最強(qiáng)，隨著發(fā)酵時間的延長抑菌活性下降[8]。不同發(fā)酵劑抑菌活性存在很大差異。有研究表明，植物乳桿菌、戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較強(qiáng)的抑制效果，木糖葡萄球菌對上述四株致病菌的抑制作用較弱[9]。

課題組前期研究了15 種發(fā)酵劑發(fā)酵16 h 制備的FBF 的抑菌性差異，并篩選得到了抑菌效果較好的3 種發(fā)酵劑[4]，分別是WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake,LS）。為縮短FBF 的生產(chǎn)周期，試驗將發(fā)酵時間縮短至12 h，考察發(fā)酵12 h 和16 h 制得的FBF 之間的抑菌效果差異。試驗以WBL-45、VHI-41、LS 為研究對象，以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphiB,S. para-typhiB）為指示菌。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牛骨肉末（骨肉比 3∶7）、木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、維生素B1，頂興（天津）食品科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；WBL-45、VHI-41，意大利薩科公司產(chǎn)品；LS，薩科商業(yè)復(fù)合菌中分離純化獲得；純牛奶，內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)；MRS 液體培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，丹麥諾維信公司產(chǎn)品；酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品。

S.aureus（ATCC6538）、S.typhimurium（ATCC14028）、S.paratyphiB（ATCC50094）、E.coli，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SX-500 型高壓蒸汽滅菌鍋，F(xiàn)riocell 22 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，3001-1339 VarioskanFlash 酶標(biāo)儀，Bluepand恒溫?fù)u床。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備方法

WBL-45 和VHI-41 兩株商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑，使用前用滅菌純牛奶活化2 h。LS 發(fā)酵劑于MRS 液體培養(yǎng)基37 ℃連續(xù)活化3 代，于4 ℃貯藏備用。

S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 接種于LB 液體培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫?fù)u床中活化3代，于4 ℃貯藏備用。

1.2.2 FBF 的制備方法

1.2.2.1 工藝流程

原料選擇（冷凍牛骨肉末）→高壓浸提→酶解→發(fā)酵（或不發(fā)酵）→美拉德反應(yīng)→離心

1.2.2.2 操作要點

（1）高壓浸提：將60 g 牛骨肉末與240 g 蒸餾水混合均勻，0.1 MPa、121 ℃下加熱 4 h。

（2）雙酶同步酶解：浸提液冷卻至室溫，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%的風(fēng)味蛋白酶和0.03%的復(fù)合蛋白酶，于50 ℃振蕩4.5 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶20 min。

（3）發(fā)酵：將 WBL-45、VHI-41、LS 分別接種至酶解液中，30 ℃下分別發(fā)酵12 h 和16 h，發(fā)酵結(jié)束后沸水浴滅菌20 min。商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑依照產(chǎn)品推薦量添加，添加量為牛骨酶解液質(zhì)量的0.02%，單菌接種量為106CFU/mL。

（4）美拉德反應(yīng)：每組在發(fā)酵液中添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8%維生素B1，攪拌均勻后在110 ℃下美拉德反應(yīng)60 min。

（5）離心：所有處理組4 ℃冷藏過夜，兩層紗布過濾去除牛油和骨渣，在2 ℃、5 000 r/min 條件下離心1 min，上清液4 ℃冷藏備用。

1.2.3 試驗方案設(shè)計

參照FBF 的制備工藝，只在發(fā)酵環(huán)節(jié)設(shè)計不同處理。試驗設(shè)計：①CK 組：不發(fā)酵；②發(fā)酵12 h：分別接種 WBL-45、VHI-41、LS 發(fā)酵劑發(fā)酵 12 h；③發(fā)酵16 h：在②的基礎(chǔ)上將發(fā)酵時間延長至16 h。通過測定 FBF 作用于E.coli、S.typhimurium、S.paratyphiB、S.aureus等指示菌的OD600nm，確定其抑菌性。

1.2.4 FBF 制備過程中pH 的測定

分別在高壓浸提、酶解、發(fā)酵、美拉德反應(yīng)等環(huán)節(jié)結(jié)束后，取樣測定pH。

1.2.5 抑菌率的測定

指示菌于37 ℃，130 r/min 活化12 h，用無菌LB將其稀釋至濃度約為107CFU/mL。吸取FBF 10 μL 與90 μL 指示菌懸液進(jìn)行混合。37 ℃反應(yīng)12 h，測定600 nm 下的 OD指示菌+FBF值。同時進(jìn)行空白對照和陽性對照，分別測定 600 nm 下的 ODLB、OD指示菌、ODLB+FBF。計算公式如下：

式中：ODLB為 100 μL LB 液體培養(yǎng)基在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌為 100 μL 指示菌在 600 nm 下的 OD值；ODLB+FBF為 90 μL LB+10 μL FBF 在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌+FBF為 90 μL 指示菌液+10 μL FBF 在600 nm 下的 OD 值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 處理數(shù)據(jù)，使用Sigma plot 10.0繪圖，用Statistix8.1 中Tukey HSD 進(jìn)行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 FBF 制備過程中pH 的變化

FBF 制備過程中pH 變化如圖1 所示。隨著各工藝環(huán)節(jié)的進(jìn)行，各處理組pH 呈整體下降趨勢。發(fā)酵結(jié)束后，12 h 組和16 h 組FBF 的pH 變化規(guī)律均表現(xiàn)為 WBL-45＞LS＞VHI-41（P＜0.05），說明 VHI-41發(fā)酵劑在3 株發(fā)酵劑中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。觀察美拉德反應(yīng)結(jié)束 pH 的變化，發(fā)酵 12 h 組（4.43～4.55）和 16 h組 FBF（4.28～4.48）顯著低于 CK 組（4.73）。對比 12 h組和16 h 組FBF 的pH 差異，發(fā)酵16 h＜發(fā)酵12 h，說明發(fā)酵處理能顯著降低FBF 的pH，隨著發(fā)酵時間的延長，F(xiàn)BF 的pH 降低更加顯著。其中VHI-41 發(fā)酵劑在3 株發(fā)酵劑中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵12 h 和16 h的pH 均保持最低水平，其成品pH 分別為4.43 和4.28。

2.2 不同處理組對E.coli 抑菌率的影響

由圖2 可以看出，CK 組和發(fā)酵組對E.coli均呈現(xiàn)較好的抑制效果。CK 組對E.coli的抑菌率為60%，發(fā)酵組對E.coli的抑菌率為76%～86%，二者間差異顯著（P＜0.05）。3 種發(fā)酵劑中，VHI-41 組的抑菌效果最佳，發(fā)酵16 h 其抑菌率高達(dá)86%，與其他處理組差異顯著（P＜0.05）；發(fā)酵12 h 抑菌率為83%，與WBL-45 發(fā)酵12 h 組無顯著性差異。抑菌性最低的是LS組（發(fā)酵12 h 和16 h 其抑菌率分別為76%和79%）。發(fā)酵時間對抑菌率的影響因菌種不同而存在差異，VHI-41 發(fā)酵劑隨著發(fā)酵時間延長對E. coli的抑菌性顯著增加（P＜0.05），而其他2 種發(fā)酵劑隨發(fā)酵時間延長抑菌性變化不顯著。由此說明，VHI-41 組發(fā)酵16 h 制得的FBF 對E.coli的抑菌效果最好。

2.3 不同處理組對S.typhimurium 抑菌率的影響

由圖 3 可以看出，CK 組對S. typhimurium的抑制率僅達(dá)到4%，發(fā)酵后FBF 抑菌性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），不同發(fā)酵劑對S. typhimurium的抑菌能力依次為：VHI-41＞LS＞W(wǎng)BL-45。發(fā)酵 12 h 組，VHI-41、LS、WBL-45 組FBF 抑菌率分別為 66%、58%、46%。發(fā)酵時間由12 h 延長至16 h 時，所有發(fā)酵組的抑菌率均顯著提高（P＜0.05），增幅最大的是WBL-45組，由46%（12 h）提高至 62%（16 h），增幅為 35%。由此說明，發(fā)酵劑的種類和發(fā)酵時間均對FBF 抑制S.typhimurium的能力產(chǎn)生較大影響，VHI-41 發(fā)酵16 h對S.typhimurium的抑制率為71.8%，在所有處理組中抑菌效果最好。

2.4 不同處理組對S.paratyphi B 抑菌率的影響

由圖4 可以看出，CK 組對S.paratyphiB 抑菌率在“0”刻度線以下，即傳統(tǒng)工藝制得的牛肉調(diào)味料對S.paratyphiB 沒有抑制作用。在制備過程中增加發(fā)酵環(huán)節(jié)，F(xiàn)BF 對S. paratyphiB 有顯著的抑制作用（P＜0.05）。相比較而言，無論發(fā)酵12 h 還是16 h，經(jīng) VHI-41 發(fā)酵制得的 FBF 對S. paratyphiB 抑菌率均達(dá)最高值（發(fā)酵12 h 為58%，16 h 為63%）。除VHI-41 之外，其余2 種發(fā)酵劑隨發(fā)酵時間延長制得的FBF 對S. paratyphiB 抑菌率增幅均較大，發(fā)酵12 h 時，WBL-45、LS 組抑菌率分別為 60%、69%，發(fā)酵16 h 其抑菌率分別上升至70%、76%。

2.5 不同處理組對S.aureus 抑菌率的影響

由圖5 可以看出，CK 組對S. aures的抑制率為25%。經(jīng)3 種發(fā)酵劑發(fā)酵12 h 后，處理組對S.aureus的抑制率增強(qiáng)，VHI-41 組最高，達(dá)61%。當(dāng)發(fā)酵時間延長至16 h 時，WBL-45 組增幅最大，抑菌率由52%（12 h）上升至 67%（16 h）。

3 討論

3.1 pH 動態(tài)變化和各處理組FBF 抑菌能力的相關(guān)性

對FBF 制作過程中pH 的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，各發(fā)酵組FBF 的pH 明顯低于CK 組，且發(fā)酵時間延長，F(xiàn)BF 的 pH 明顯降低，其中 VHI-41 組 pH 始終維持在較低水平。觀察不同處理組對4 個指示菌的抑制情況，可以發(fā)現(xiàn)類似的趨勢，即各發(fā)酵組抑菌效果優(yōu)于CK 組，發(fā)酵時間延長，抑菌能力提高。VHI-41 組抑菌效果最好，F(xiàn)BF 的抑菌能力可能與乳酸菌生長繁殖過程中提供的低pH 環(huán)境有關(guān)。

3.2 各處理組FBF 的抑菌差異分析

研究發(fā)現(xiàn)，肉品發(fā)酵過程中常見的細(xì)菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬以及葡萄球菌屬幾大類[10-11]，這些發(fā)酵劑可提高肉品安全性和風(fēng)味[12-13]。試驗所采用的發(fā)酵劑包括WBL-45、VHI-41 和LS。其中木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌因能促進(jìn)肉品蛋白質(zhì)和脂肪的水解常被用于改善肉制品色澤，提高肉品的食用品質(zhì)[14]；清酒乳桿菌、植物乳桿菌則能有效降低肉制品中pH，抑制致病菌的生長[15-16]；此外，清酒乳桿菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素也具有較好的抑菌性，目前已報道的清酒乳桿菌細(xì)菌素以Ⅱa 類細(xì)菌素為主，Ⅱa是分子量小于10 kDa 的小分子熱穩(wěn)定肽[17]，可通過破壞細(xì)胞膜完整性，增大膜通透性，引起胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)外流，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[18]。戊糖片球菌在發(fā)酵過程中同樣能降低環(huán)境pH[19]，產(chǎn)生耐熱、耐酸堿、具有廣譜抑菌性的細(xì)菌素，抑制致病菌和腐敗菌的生長繁殖[20]。對比3 組發(fā)酵劑組成，VHI-41 發(fā)酵劑中乳桿菌比例較高，這可能是VHI-41 發(fā)酵劑抑菌效果優(yōu)于其他兩株發(fā)酵劑的原因。

4 結(jié)論

試驗研究3 組發(fā)酵劑發(fā)酵12 h 和16 h 制得的FBF 的抑菌性能差異。試驗結(jié)果表明：

（1）CK 組對S. aureus、S. typhimurium、E. coli的抑制率分別為25%、4%、60%，對S.paratyphiB 無抑制作用。發(fā)酵處理使得FBF 抑菌率上升。發(fā)酵12 h，各組 FBF 對S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 的抑菌率分別為 52%～59%、46%～66%、76%～83%、60%～78%，隨著發(fā)酵時間的延長，各處理組抑菌率分別上升至 58%～67%、62%～71%、79%～86%、70%～83%。

（2）3 個發(fā)酵劑組中，隨著時間的延長，WBL-45組增幅最高，VHI-41 組的抑菌效果最好，發(fā)酵16 h對E. coli、S. typhimurium、S. paratyphiB、S. aureus指示菌的抑菌率分別達(dá)到86%、71%、63%、59%。對比VHI-41 組12 h 和16 h 的抑菌性差異發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間對該發(fā)酵劑的抑菌性影響較小。

（3）在保證FBF 抑菌性的前提下，為縮短FBF 的生產(chǎn)周期，可選用VHI-41 發(fā)酵12 h 的工藝進(jìn)行FBF的制作。