李子怡，李志君，顧麗莉，師君麗，陳昱安，韓毅，佟振浩，孔光輝

（1 昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650500；2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南玉溪653100）

三唑類殺菌劑是一類含有1,2,4-三唑環(huán)的化合物，由于其低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于果蔬和稻谷等病蟲害的防治[1]。楊益軍[2]統(tǒng)計(jì)了2015 年全球銷售額前15 位的殺菌劑，三唑類有5種，占1/3。但隨著三唑類農(nóng)藥的大量應(yīng)用，其在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的殘留問題也逐漸引起人們的關(guān)注。目前，三唑類殺菌劑殘留量的測定方法[3-12]主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法和生物免疫檢測法等，這些檢測方法均要求配備高效的樣品前處理過程。

近年來，基于分子印跡技術(shù)的三唑類殺菌劑殘留分析已有報(bào)道。佘永新等[13]研發(fā)了一種三唑類分子印跡聚合物微球固相萃取柱，微球粒徑為2μm左右，該報(bào)道沒有明確聚合物粒徑與其吸附性能的關(guān)系；胡艷云等[1]建立了三唑酮分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中多種三唑類農(nóng)藥的檢測，但其特異性吸附效果不顯著，最大印跡因子為1.45。針對三唑類分子印跡聚合物顆粒粒度較大（1～2μm 及以上）、粒徑分布寬、團(tuán)聚現(xiàn)象明顯、印跡效果不顯著等問題，本文制備了一種粒度高度均勻、特異吸附性能良好的分子印跡納米球，該納米球?qū)δ０宸肿蛹捌浣Y(jié)構(gòu)類似物具有良好的選擇性吸附能力和較高的印跡效應(yīng)。由此分子印跡納米球組裝的固相萃取柱用于煙草樣品的前處理，對煙草樣品中三唑類殺菌劑的檢測效果良好，為復(fù)雜基質(zhì)中該類農(nóng)殘的檢測提供了有效手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器與材料

掃描電子顯微鏡（SEM），Tecnai G2 TF30 STwin 型，荷蘭FEI 公司；馬爾文粒度分析儀，Zetasizer Nano ZS90 型，美國Malvern Inc；傅里葉紅 外 光 譜 儀（FTIR）， Equinox55 型， 德 國BRUKER 公司；臺式高速離心機(jī)，TG16-WS 型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-2000A 型，上海亞榮生化儀器廠；氣浴恒溫振蕩器，ZD-85 型，金壇市城東新瑞儀器廠；超高效液相色譜儀，Agilent 1290 Infinity UHPLC 型，美國Agilent Technologies；質(zhì)譜儀，AB Sciex Qtrap (TM) 3200 MS/MS 型，美國AB Sciex，CA。

三唑酮（triadimefon，TDF），標(biāo)準(zhǔn)品純度為99%，AccuStandard；三環(huán)唑（tricyclazole，TCZ），標(biāo)準(zhǔn)品純度為99%，阿拉丁上海試劑有限公司；腈菌唑（myclobutanil，MT），標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.5%，阿拉丁上海試劑有限公司；亞胺唑（imibenconazole，IBZ）、烯唑醇（diniconazole，DNZ）、戊 唑 醇（tebuconazole，TEB）、己 唑 醇（hexaconazole，HXZ）、氯 磺 ?。╟hlorsulfuron，CS）和莠去津（atrazine,ATZ），標(biāo)準(zhǔn)品純度為97%、99.2%、99.3%、98%、99%和99%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；丙環(huán)唑（propiconazole，PPZ），純度為91.3%，CATO Research Chemicals Inc.；氟硅唑（flusilazole，F(xiàn)SZ），標(biāo)準(zhǔn)品純度為98%，天津希恩思生化科技有限公司；偶氮二異丁腈[2,2′-azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN]和乙二醇二甲基丙 烯 酸 酯 （ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA），分析純，北京百靈威科技有限公司。

1.2 三唑類分子印跡預(yù)組裝體系的計(jì)算機(jī)模擬

本文采用密度泛函理論（density functional theory，DFT）[14-16]，通過Gaussian09 模擬計(jì)算了5種功能單體分別與TDF 的復(fù)合物構(gòu)型、結(jié)合能及其強(qiáng)度分布，推測出不同功能單體與TDF 的聚合比例；計(jì)算了最佳復(fù)合物在5種溶劑中的溶劑化能與偶極矩；進(jìn)而估算了最佳復(fù)合物在最優(yōu)溶劑中自組裝過程的熱力學(xué)性質(zhì)和紅外光譜圖。

1.3 三唑酮分子印跡納米球制備條件

100mL硼硅酸玻璃瓶中依次加入0.2mmol TDF、0.8mmol MAA 和50mL 乙腈，混合均勻，30℃下超聲通N210min 后置于30℃恒溫氣浴振蕩器中預(yù)聚12h，然后加入30mg AIBN和4mmol EGDMA，混合均勻，通N210min后置于30℃恒溫水浴震蕩器，隨后將溫度緩慢升至60℃，聚合24h。聚合結(jié)束后，將聚合物靜置至室溫，在10000r/min 下離心分離，倒掉上清液，將干燥后的聚合物放入索氏提取器，用甲醇∶乙酸=9∶1 重復(fù)洗脫聚合物中的模板分子，至超高效液相色譜（UHPLC）檢測上清液中無TDF 為止。繼而用甲醇洗滌聚合物呈中性后，將聚合物置于50℃下真空干燥至恒重，得到三唑酮分子印跡聚合物（TDF-MIPs）。作為對照，非分子印跡聚合物（NIPs）的制備除了不加入模板分子外，所有步驟與MIPs的制備一致[17-20]。

1.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20mg 的MIPs 和NIPs 各12 份于10mL離心管中，分別加入不同濃度（0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L 和25mg/L）的TDF-乙腈溶液5mL。將離心管在25℃下恒溫振蕩8h，然后在8000r/min 下離心10min，取3mL 上清液用0.22μm濾膜過濾后用UHPLC 檢測TDF 的濃度。該過程平行實(shí)驗(yàn)3次，檢測結(jié)果取平均值[21-22]。

1.5 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20mg MIPs 和NIPs 各11份于10mL 離心管中，分別加入5mL 濃度為20mg/L 的不同種類農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液。將離心管在25℃下恒溫振蕩8h 后，在8000r/min 下離心10min，取3mL 上清液過0.22μm 濾膜后用UHPLC 檢測各種農(nóng)殘的濃度。該過程平行實(shí)驗(yàn)3次，檢測結(jié)果取平均值。

1.6 分子印跡固相萃取柱的裝填

準(zhǔn)確稱取若干份100mg 的MIPs 及NIPs，分別裝填于3mL 的固相萃取空柱中，填料上下兩端放置0.45μm 濾 膜， 制 得MISPE 柱（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）和NISPE柱（noimprinted solid phase extraction，NISPE）。

表1 9種三唑類殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限和定量限

分別稱取9 種三唑類殺菌劑10mg 溶于乙腈溶液，配制為100mg/L混標(biāo)溶液，然后稀釋為不同濃度（0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1mg/L和2mg/L），采用UHPLC-MS/MS分析檢測。色譜柱條件為：Waters BEH-C18（2.1mm×150mm，1.7μm）；流速，0.3 mL/min；檢測波長，228nm；進(jìn)樣量，1μL；柱溫，30℃；洗脫方式，梯度洗脫，流動相A、B分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。質(zhì)譜儀條件為：電噴霧離子源；離子噴射電壓，5500V；霧化溫度，550℃；掃描方式，正離子掃描；檢測方法，多反應(yīng)檢測模式。以殺菌劑的濃度為橫坐標(biāo)X，響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)Y，在不加權(quán)的情況下對檢測結(jié)果進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到9種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示。數(shù)據(jù)表明，9種殺菌劑在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9995），檢測限為4.82～11.97ng/mL（S/N≥3），定量限為16.07～39.90ng/mL（S/N≥10）。

1.8 煙葉樣品及煙葉上樣液的制備

將煙葉破碎后過40 目篩，在50℃恒溫真空干燥至恒重。稱取若干份1g 干燥煙葉樣品，分別置于10mL 離心管中，添加不同濃度的9 種農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，加標(biāo)濃度分別為0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g、0.5μg/g，然后渦旋振蕩5min 使其充分混勻，室溫靜置24h 后放入50℃真空干燥箱干燥2h，即得到加標(biāo)煙葉樣品。

向加標(biāo)煙葉樣品中加入10mL 乙腈，30℃下超聲萃取30min后離心收集上清液，過0.22μm濾膜，將濾液轉(zhuǎn)移到50mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，待旋蒸。濾渣與離心管底部的煙葉萃余物合并，再加入5mL 乙腈進(jìn)行第二次萃?。ㄝ腿l件同第一次）。合并兩次萃取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用1mL 乙腈復(fù)溶，得煙葉上樣液。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 三唑類分子印跡預(yù)組裝體系的計(jì)算機(jī)模擬

2.1.1 模板分子與功能單體的構(gòu)型優(yōu)化

模板分子TDF 與5 種單體（TFMAA、AA、AM、MAA 和4-VP）的幾何構(gòu)型及靜電勢分布如圖1所示。TDF有3個失電子和1個弱受電子位置，AA、AM和MAA均各有1個失電子和1個受電子位置，TFMAA 有一個受電子位置，4-VP 有1 個失電子位置，根據(jù)電正性和電負(fù)性越強(qiáng)的地方形成非共價(jià)鍵的活性越高原理[15]，可初步判斷模板分子與功能單體的最大結(jié)合比例。

圖1 TDF與單體TFMAA、AA、AM、MAA和4-VP的靜電勢分布圖

2.1.2 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及配比優(yōu)化

TDF 與5 種功能單體的相互作用能（ΔE）、鍵長與鍵角列于表2。從表2中可見，AM與TDF的相互作用能較低，而且小于自身締合作用，為不可選功能單體。4-VP 與TDF 的鍵長已超出典型氫鍵鍵長1.627～2.169?（1?=0.1nm）[23-24]范圍，無法與TDF 形成預(yù)聚合物。MAA 與TFMAA 在AA 結(jié)構(gòu)上增加甲基或三氟甲基，可增加AA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，增強(qiáng)羥基H 的受電子能力；TFMAA 的三氟甲基具有電負(fù)性，消減了羥基H 給電子能力，MAA 中的羥基H給電子能力更強(qiáng)。TDF的3個失電子元素分別與三分子MAA 的受電子元素形成3 個氫鍵，而TDF上的1個弱受電子元素與MAA的1個失電子元素不能形成氫鍵，且TDF-MAA 復(fù)合物的|ΔE|高于TDF-TFMAA 復(fù)合物的|ΔE|。表3 是TDF 與MAA 和TFMAA 在各結(jié)合點(diǎn)位的作用能。由表3 和圖1 可見，TDF 在O3、N5 和N6三個個結(jié)合位點(diǎn)可以接受質(zhì)子，原子電荷數(shù)分別為-0.311、-0.312和-0.311，均可與TFMAA和MAA形成氫鍵結(jié)構(gòu)。TDF在N5與MAA 的相互作用結(jié)合能較大，在N6 和O3 的結(jié)合能相近，且3個結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能相近；而TDF與TFMAA 在N6 的結(jié)合能與在N5和O3的結(jié)合能差異較大。因此，TDF-MAA 比TDF-TFMAA 的復(fù)合結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定[25-26]。后續(xù)MIPs 的制備中采用MAA 為功能單體，并考慮TDF 與MAA 之間存在的氫鍵之外的弱作用力影響，選擇TDF 與MAA 的聚合比例為1∶4。圖2為TDF與4種功能單體的預(yù)聚合構(gòu)型優(yōu)化及配比情況[27]。

表2 TDF與5種單體相互作用能ΔE、鍵長與鍵角

表3 TDF與MAA和TFMAA各結(jié)合點(diǎn)位的作用能

實(shí)驗(yàn)中，通過檢測不同配比下[(1∶1)～(1∶4)]預(yù)聚合物的紫外光譜。在1∶4 時，吸光度最小，說明TDF 與MAA 自組裝過程最強(qiáng)，進(jìn)而印證了TDF與MAA配比為1∶4時自組裝效果最佳[28-29]。

2.1.3 溶劑的選擇

圖2 TDF分別與4種功能單體形成復(fù)合物的幾何結(jié)構(gòu)

溶劑對TDF-MAA 復(fù)合物的溶劑化會促進(jìn)氫鍵斷裂和降低反應(yīng)活性。將實(shí)驗(yàn)與模擬結(jié)合可快速選擇最佳溶劑，制備方法為沉淀聚合法。分別選擇了微孔型甲苯、氯仿、大孔型二氯甲烷、乙腈和水5種溶劑對印跡體系的溶劑化效應(yīng)進(jìn)行模擬研究[30]。如表4所示，ΔE溶劑越大說明溶劑對TDF-MAA復(fù)合物結(jié)構(gòu)影響越大，越不利于形成氫鍵，不利于自組裝過程的進(jìn)行，按照溶劑化能從小到大的順序排序：甲苯＜氯仿＜二氯甲烷＜乙腈＜水，取前4種有機(jī)溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較。

表4 TDF-MAA在5種溶劑中的溶劑化能和偶極矩

在相同條件下，制備4 種溶劑的MIPs，結(jié)果表明：以甲苯和二氯甲苯為溶劑所制備的MIPs 產(chǎn)量少，團(tuán)聚明顯，球形度差，粒徑誤差大。氯仿-MIPs 微球粒徑為1000nm 左右，乙腈-MIPs 微球粒徑在200～300nm 之間，乙腈-MIPs 微球的比表面積遠(yuǎn)高于氯仿-MIPs 微球，進(jìn)一步用20mg/L TDF溶劑作為吸附質(zhì)進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：乙腈-MIPs 最 大 吸 附 量 是955.3μg/g，而 氯 仿-MIPs 是250μg/g，相差3.8倍。大孔溶劑形成的大孔結(jié)構(gòu)更利于物質(zhì)擴(kuò)散，適當(dāng)提高大孔數(shù)量將有利于MIPs對模板分子及其類似物的識別能力。故而，乙腈是沉淀聚合法制備TDF-MIPs的適宜溶劑。

2.1.4 復(fù)合物的紅外光譜分析

圖3(a)為復(fù)合物在真空介質(zhì)和乙腈溶劑中模擬的紅外光譜圖，圖3(b)為乙腈-MIPs 紅外光譜圖。比較乙腈-復(fù)合物的模擬光譜線和乙腈-MIPs 實(shí)體的光譜線，兩者的主要吸收峰位置相似，說明計(jì)算機(jī)模擬的紅外光譜具有相對準(zhǔn)確性。與真空介質(zhì)對比，兩者的吸收光譜均發(fā)生紅移現(xiàn)象，表明預(yù)聚合反應(yīng)中模板與單體氫鍵結(jié)合的激發(fā)態(tài)能量傳遞給乙腈分子，基團(tuán)在乙腈中振動所需的能量降低，直接影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由此可見有必要考察適宜的溶劑用量，有益于形成穩(wěn)定的聚合物結(jié)構(gòu)。

圖3 模擬TDF-MAA復(fù)合結(jié)構(gòu)和乙腈-TDF-MIPs紅外光譜圖

在相同條件下，改變乙腈用量（30mL、40mL、50mL、60mL、70mL 和80mL）制備了6 種不同的TDF-MIPs 和NIPs。通 過UHPLC 檢 測6 種TDFMIPs 和NIPs 的飽和吸附量（20mg/L TDF-乙腈溶劑），計(jì)算其印跡因子，如表5 所示，結(jié)果表明：隨著溶劑量的增加，TDF-MIPs 微球飽和吸附量先增加后減少，與印跡因子的變化規(guī)律一致，其中，溶劑量50mL的MIPs微球分布分布最窄，平均粒徑較小，其吸附性和結(jié)構(gòu)性更穩(wěn)定。

表5 不同溶劑用量下MIPs的飽和吸附量、印跡因子與粒度特征

2.1.5 復(fù)合物自組裝過程的熱力學(xué)分析

在特定溫度下，根據(jù)正則系綜理想氣體估算分子熱力學(xué)數(shù)據(jù)（H、G和S）[15]。模擬中選擇不同溫度（0～30℃）和不同介質(zhì)（真空與乙腈）下，對復(fù)合物自組裝過程：TDF+3MAATDF-MAA 進(jìn)行熱力學(xué)分析，表6 是復(fù)合物自組裝過程的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG）。

由表6可見，復(fù)合物形成過程中，ΔH和ΔG均大于零，ΔS 為負(fù)值，隨著溫度的升高，三者均有小幅度增加，表明TDF-MAA預(yù)聚合反應(yīng)是非自發(fā)吸熱反應(yīng)，但溫度對反應(yīng)影響不大，實(shí)驗(yàn)中選擇30℃進(jìn)行預(yù)聚合反應(yīng)。

2.2 三唑酮分子印跡聚合物納米球性能表征

表征最優(yōu)條件（1.3 節(jié)）下的TDF-MIPs 的形貌、粒徑等基本性能。

圖4(a)中TDF-MIPs 粒徑在200nm 左右，無粘連和團(tuán)聚現(xiàn)象，非平滑均勻準(zhǔn)球表明存在大量多層次褶皺，預(yù)示該聚合物有較大的比表面積，有利于目標(biāo)化合物的吸附和脫附。從TDF-MIPs 粒度分布圖4(b)顯而易見，聚合物粒徑均勻，主要集中在190～220nm，與場發(fā)射掃描電鏡結(jié)果一致。

圖4 TDF-MIPs的形貌和粒徑圖

圖5 TDF、TDF-MIPs與NIPs的紅外光譜圖

TDF、TDF-MIPs 洗脫前、TDF-MIPs 洗脫后及NIPs 的紅外光譜見圖5。TDF-MIPs 洗脫前光譜圖中出現(xiàn)4 處明顯特征峰，波數(shù)673.7cm-1處是C Cl伸縮振動峰；1586.4cm-1處是芳環(huán)中C C伸縮振動峰，即TDF中苯環(huán)的骨架振動；1665cm-1處是羰基C O伸縮振動峰，因在NIPs和TDF-MIPs洗脫后未出峰，可以排除是甲基丙烯酸中的羰基，則此處為TDF中的羰基；3130cm-1處為苯環(huán)上不飽和的C H伸縮振動峰，TDF 在以上4 處均有對應(yīng)峰值出現(xiàn)。由此證明，聚合物中存在TDF 分子；對比圖TDFMIPs洗脫后，不存在這4處特征峰，說明聚合物中的TDF分子被完全洗脫。此外，分析以上4個紅外光譜圖所共有的較強(qiáng)特征峰發(fā)現(xiàn)，1158cm-1處可能為交聯(lián)劑EGDMA 中O C O 的伸縮振動峰；1257cm-1處可能為功能單體MAA 羧基中C O 的伸縮振動峰；1730cm-1處為EGDMA 和MAA 中C O的伸縮振動峰。綜上，可以證明EGDMA 和MAA的存在，并且模板分子與功能單體、交聯(lián)劑發(fā)生了共聚反應(yīng)。

表6 在不同條件下復(fù)合物形成過程的熱力學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)

2.3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

圖6(a)是TDF-MIPs及NIPs在不同TDF-乙腈溶液中的吸附量。從圖6(a)中可以看出，MIPs的結(jié)合量隨著TDF 濃度的增加而增加，因具有高親和吸附位點(diǎn)（特異性吸附）和低親和吸附位點(diǎn)（表面吸附特性），相比只有表面吸附特性的NIPs有更高的吸附容量。圖6(b)為Scatchard分析后線性擬合結(jié)果圖，分別擬合得到MIPs高親和直線與低親和直線，兩者斜率不同，說明TDF-MIPs 存在兩類吸附位點(diǎn)。根據(jù)Scatchard分析，計(jì)算得到高親和位點(diǎn)的解離常數(shù)為15.237μg/mL和最大表觀結(jié)合量是1502.582 μg/g。低親和位點(diǎn)的解離常數(shù)為2.039μg/mL和最大表觀結(jié)合量是522.99μg/g。

2.4 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

圖6 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖

圖7 TDF-MIPs和NIPs的選擇性吸附及印跡因子

為了考察所制備的TDF-MIPs選擇性識別能力，選用9 種常見三唑類殺菌劑、1 種磺酰脲類和1 種三嗪類除草劑為目標(biāo)物，檢測TDF-MIPs對以上11種農(nóng)藥的吸附量。結(jié)果如圖7所示。

圖7 表明，除氟硅唑外，TDF-MIPs 對上述8種三唑類殺菌劑具有良好的吸附性，最大印跡因子可達(dá)到2.42，相較于NIPs，MIPs 的吸附量和特異吸附性均較高。TDF-MIPs 的孔穴在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合點(diǎn)位上與TDF 分子切合，能夠有效地嵌入TDF實(shí)現(xiàn)特異性吸附和分離，而分子結(jié)構(gòu)的類似性使TDF-MIPs 對三唑類化合物具有普遍的特異吸附性。相對而言，NIPs 僅能對各種農(nóng)殘分子進(jìn)行表面吸附。對于氟硅唑，其分子量大、空間結(jié)構(gòu)與TDF 分子的結(jié)構(gòu)差異較大，TDF-MIPs 的主要作用為表面吸附，其MIPs 與NIPs 的吸附量基本一致，更小粒徑的NIPs 反而有更高的表面吸附量。TDFMIPs 對非類似結(jié)構(gòu)的氯磺隆和莠去津基本無特異性吸附。

2.5 三唑酮分子印跡聚合物納米球的應(yīng)用

取空白煙葉樣品，按照1.7 節(jié)和1.8 節(jié)進(jìn)行制樣、樣品前處理和檢測，計(jì)算回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表7。由表7 可見，除氟硅唑外，其他8種三唑類殺菌劑在加標(biāo)濃度為0.01～0.5μg/g 范圍內(nèi)的平均回收率為70.14%～105.43%，多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%～2.27%。同一濃度水平下，三唑酮和腈菌唑的平均回收率達(dá)95%以上，戊唑醇、己唑醇和烯唑醇高于85%，丙環(huán)唑、三環(huán)唑和亞胺唑大于70%，氟硅唑僅為50%～60%，TDF-MIPs的吸附性能與2.4節(jié)的選擇性吸附結(jié)論一致。

3 結(jié)論

本文以沉淀聚合法制備了粒度高度均勻、特異性吸附性能良好的TDF-MIPs 納米微球，并以TDF-MIPs 為吸附劑，對煙葉樣品進(jìn)行固相萃取前處理，建立了TDF-MISPE-UPLC-MS/MS 方法對煙葉中8種三唑類殺菌劑的殘留進(jìn)行同時檢測。研究主要分為計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)兩部分。

表7 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

（1）運(yùn)用Gaussian09軟件針對TDF篩選最優(yōu)功能單體MAA，分析了TDF 與MAA 潛在的結(jié)合位點(diǎn)并得到最大配比數(shù)；模擬了常用的5種不同極性與致孔特性的溶劑對TDF-MAA溶劑化效應(yīng)，并通過實(shí)驗(yàn)確定乙腈為沉淀聚合溶劑；估算了TDF-MAA在真空和乙腈中的預(yù)聚合過程與紅外光譜圖，從熱力學(xué)角度分析得到TDF+MAATDF-MAA 為吸熱非自發(fā)過程，確定預(yù)聚合溫度為30℃。

（2）通過改變?nèi)軇┖陀昧康玫搅司酆衔镒罴雅浔萒DF∶MAA∶EGDMA=1∶4∶20，乙腈50mL，AIBN 0.03g；所得TDF-MIPs 納米顆粒均勻，平均粒徑為200nm，最佳飽和吸附量可達(dá)955.3μg/g，對模板分子的分離印跡因子達(dá)到2.42，對其他常用三唑類殺菌劑也具有良好的特異性吸附能力。

（3）以TDF-MIPs 為吸附劑，對煙葉樣品經(jīng)固相萃取柱進(jìn)行前處理，并用UPLC-MS/MS 分析前處理液，煙葉中8種三唑類殺菌劑的固相萃取回收率為70.14%～105.43%，檢出限為4.82～11.97ng/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%～2.27%（n=6），由此建立了TDF分子印跡固相萃取-超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用方法，并對煙葉中8種三唑類殺菌劑（三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、丙環(huán)唑、三環(huán)唑及亞胺唑）的殘留進(jìn)行檢測，達(dá)到了復(fù)雜基質(zhì)煙葉中多種痕量三唑類殺菌劑同時檢測的要求。