趙節(jié)昌 ，蔡望秋，陳尚龍 ，陳安徽 ，李超

1. 徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院（徐州 221018）；2. 徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（徐州 221018）

Se是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，它可以增強(qiáng)人體免疫力[1]。人體內(nèi)所需的Se一般是通過食物攝入，平時(shí)吃的食品中Se含量極低，如果不適量增加一些富硒產(chǎn)品，很容易導(dǎo)致人體缺Se，影響人體健康[2-3]，如何科學(xué)地補(bǔ)Se已成為研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)富硒產(chǎn)品的深入研究，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到高品質(zhì)富硒產(chǎn)品不僅取決于Se的含量，還與Se的形態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)[4-8]，Se在人體內(nèi)的生物活性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)[9]。人體對(duì)食品中無(wú)機(jī)Se吸附低，而對(duì)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)換的有機(jī)Se吸收高[10-14]。因此，與無(wú)機(jī)Se相比，食品中有機(jī)Se對(duì)人體科學(xué)補(bǔ)Se更為重要。

試驗(yàn)以富硒大蒜為研究對(duì)象。首先，根據(jù)DBS 42/002—2014對(duì)富硒大蒜進(jìn)行處理，制備出大蒜中總Se和無(wú)機(jī)Se待測(cè)試樣；其次，根據(jù)GB 1903.21—2016對(duì)富硒大蒜進(jìn)行處理，制備出大蒜中無(wú)機(jī)Se待測(cè)試樣；然后，再使用高分辨-連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜（High resolution-continuum source graphite furnace atomic absorption spectrophotometry，HR-CS GFAAS）[15-19]法進(jìn)行測(cè)定；最后，根據(jù)“有機(jī)Se含量（μg/g）=總Se含量（μg/g）-無(wú)機(jī)Se含量（μg/g）”計(jì)算出富硒大蒜中有機(jī)Se含量[20]。比較這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大蒜中無(wú)機(jī)Se測(cè)定的影響，為進(jìn)一步研究測(cè)定富硒大蒜中有機(jī)Se含量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒大蒜，以市售新鮮富硒大蒜為原料，在105℃干燥至恒質(zhì)量后粉碎。

HNO3等化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；18.2 MΩ·cm超純水；氬氣（純度大于99.99%）；玻璃器皿均用體積分?jǐn)?shù)5% HNO3溶液浸泡24 h以上。

1.2 方法

1.2.1 儀器工作參數(shù)

選擇196.026 7 nm作為Se分析譜線，高純氬氣作為載氣，1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液作為基體改進(jìn)劑，基體改進(jìn)劑添加體積為4 μL，灰化溫度為1 100 ℃，原子化溫度為2 200 ℃，原子化升溫速度為1 500 ℃/s。

1.2.2 基體改進(jìn)劑溶液的配制

用0.5% HNO3溶液溶解0.1 g Pd(NO3)2和0.05 g Mg(NO3)2，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，再用此溶液定容至刻度，配制成1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液。同理，配制10 g/L NH4H2PO4、1 g/L Mg(NO3)2、1 g/L Pd(NO3)2和1 g/L NH4NO3。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

通過逐級(jí)將1 g/L Se標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.6 mg/L Se標(biāo)準(zhǔn)使用液，再通過MPE自動(dòng)進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度梯度0.03，0.09，0.15，0.30，0.45和0.60 mg/L。

1.2.4 樣品前處理

大蒜中總Se測(cè)定試樣的制備：準(zhǔn)確稱取0.7 g（精確至0.1 mg）富硒大蒜干粉，其他步驟參照DBS 42/002—2014，制備出大蒜中總Se測(cè)定試樣。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

大蒜中無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣1制備：準(zhǔn)確稱取0.7 g（精確至0.1 mg）富硒大蒜干粉，其他步驟參照DBS 42/002—2014，制備出大蒜中無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣1。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

大蒜中無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣2制備：準(zhǔn)確稱取0.7 g（精確至0.1 mg）富硒大蒜干粉，其他步驟參照GB 1903.21—2016，制備出大蒜中無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣2。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 基體改進(jìn)劑的優(yōu)化

使用HR-CS GFAAS測(cè)定Se元素時(shí)，添加適量適合的基體改進(jìn)劑可以降低或消除基體對(duì)Se元素測(cè)定的干擾，減少Se的損失。試驗(yàn)選擇10 g/L NH4H2PO4、1 g/L Mg(NO3)2、1 g/L Pd(NO3)2、1 g/L NH4NO3、1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液作為基體改進(jìn)劑[8]，研究對(duì)測(cè)定Se吸光度的影響，結(jié)果如圖1所示。不添加基體改進(jìn)劑時(shí)，Se的吸光度較小，僅為0.153；以1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液為基體改進(jìn)劑，Se的吸光度增加最明顯，增幅高達(dá)131%；以1 g/L Pd(NO3)2或1 g/L Mg(NO3)2作為基體改進(jìn)劑，也可以有效地提高Se的吸光度。因此，添加適合的基體改進(jìn)劑可以有效地減少Se的損失。

2.1.2 基體改進(jìn)劑添加體積的優(yōu)化

使用HR-CS GFAAS測(cè)定Se元素時(shí)，為了降低或消除基體對(duì)Se元素測(cè)定的干擾，減少Se的損失，試驗(yàn)以1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液為基體改進(jìn)劑，研究其添加體積對(duì)測(cè)定Se吸光度的影響，結(jié)果如圖2所示。不添加基體改進(jìn)劑時(shí)，Se的吸光度較小，僅為0.153；添加1 μL基體改進(jìn)劑，Se的吸光度增幅達(dá)64%；當(dāng)添加體積≥4 μL時(shí)，Se的吸光度趨于穩(wěn)定。因此，添加適量的基體改進(jìn)劑可以有效地減少Se的損失。

圖1 基體改進(jìn)劑對(duì)吸光度的影響

圖2 基體改進(jìn)劑添加體積對(duì)吸光度的影響

2.1.3 灰化溫度的優(yōu)化

使用HR-CS GFAAS測(cè)定Se元素時(shí)，過低的灰化溫度會(huì)導(dǎo)致灰化不徹底，過高的灰化溫度會(huì)導(dǎo)致Se揮發(fā)損失。試驗(yàn)研究灰化溫度對(duì)測(cè)定Se吸光度的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)灰化溫度為1 100 ℃時(shí)，Se的吸光度達(dá)到最大，之后緩慢下降。

圖3 灰化溫度對(duì)吸光度的影響

2.1.4 原子化溫度的優(yōu)化

使用HR-CS GFAAS測(cè)定Se元素時(shí)，過低的原子化溫度無(wú)法使Se徹底原子化，過高的原子化溫度會(huì)影響石墨管等使用，試驗(yàn)研究原子化溫度對(duì)測(cè)定Se吸光度的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)原子化溫度為2 200 ℃時(shí)，Se的吸光度達(dá)到最大，之后趨于穩(wěn)定。

圖4 原子化溫度對(duì)吸光度的影響

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表1，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表2。

由表1可知，基體改進(jìn)劑對(duì)Se吸光度的影響最強(qiáng)，影響強(qiáng)弱順序?yàn)锳＞B＞C＞D，且分析最佳測(cè)定條件為A1B3C2D2；由表2可知，基體改進(jìn)劑和基體改進(jìn)劑添加體積對(duì)Se吸光度的影響顯著（p＜0.05），灰化溫度和原子化溫度對(duì)Se吸光度的影響不顯著。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性與重現(xiàn)性，在分析最佳測(cè)定條件A1B3C2D2下，重復(fù)測(cè)定6次，Se平均吸光度為0.375（高于試驗(yàn)最佳值0.362），RSD=2.25%。因此最佳測(cè)定條件為A1B3C2D2，即以1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液為基體改進(jìn)劑、基體改進(jìn)劑添加體積4 μL、灰化溫度1 100 ℃、原子化溫度2 200 ℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

通過ASpect CS軟件設(shè)置Se的檢測(cè)方法，將0.60 mg/L Se標(biāo)準(zhǔn)使用液、1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液、空白溶液和待測(cè)溶液放入MPE自動(dòng)進(jìn)樣器，使用HR-CS GFAAS進(jìn)行測(cè)定。所得的非線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖5，回歸方程為A=（0.037 312 5+0.917 625 5c）/（1+0.304 683 9c），相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表3。參照DBS 42/002—2014和GB 1903.21—2016測(cè)定富硒大蒜中總Se和無(wú)機(jī)Se的加標(biāo)回收率，結(jié)果為92.4%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.2%，表明參照DBS 42/002—2014和GB 1903.21—2016測(cè)定富硒大蒜中Se，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.5 富硒大蒜中有機(jī)Se的測(cè)定

參照DBS 42/002—2014制備出測(cè)定總Se測(cè)定試樣，分別參照DBS 42/002—2014和GB 1903.21—2016制備出2種無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣，在最佳試驗(yàn)條件下測(cè)定總Se和無(wú)機(jī)Se的含量，結(jié)果見表4。參照DBS 42/002—2014測(cè)定富硒大蒜中總Se為7.541 μg/g，參照DBS 42/002—2014和GB 1903.21—2016測(cè)定富硒大蒜中無(wú)機(jī)Se分別為2.915和1.256 μg/g。通過計(jì)算得富硒大蒜中有機(jī)Se分別為4.626和6.285 μg/g，占總Se的61.34%和83.34%。從數(shù)據(jù)上分析，參照DBS 42/002—2014測(cè)定富硒大蒜中有機(jī)Se含量偏低，這是參照DBS 42/002—2014在制備無(wú)機(jī)Se測(cè)定試樣時(shí)，由于富硒大蒜干粉中存在很多較細(xì)顆粒，“在4 000 r/min條件下離心15 min”無(wú)法將固液完全分離，在上清液中存在一定量的懸浮細(xì)小顆粒，這些固體中的有機(jī)Se被當(dāng)作無(wú)機(jī)Se，導(dǎo)致無(wú)機(jī)Se含量偏高，有機(jī)Se含量偏低。參照GB 1903.21—2016在制備無(wú)機(jī)Se時(shí)，由于使用95%乙醇作為提取無(wú)機(jī)Se的溶液，并在冰箱靜置1 h且只對(duì)上清液進(jìn)行離心分離，離心時(shí)間較長(zhǎng)（30 min），這些都有助于固液分離，使富硒大蒜干粉中有機(jī)Se與無(wú)機(jī)Se完全分離（上清液中無(wú)懸浮顆粒），所測(cè)數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確。因此，富硒大蒜中總Se含量為7.541 μg/g，無(wú)機(jī)Se含量為1.256 μg/g，有機(jī)Se含量為6.285 μg/g，有機(jī)Se含量高達(dá)83.34%，這說(shuō)明富硒大蒜含有豐富的有機(jī)Se，是補(bǔ)Se良品。

表3 加標(biāo)回收率（n=3）

表4 富硒大蒜中Se的含量（n=3）

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到測(cè)定Se最佳條件：以1 g/L Pd(NO3)2和0.5 g/L Mg(NO3)2混合溶液為基體改進(jìn)劑、基體改進(jìn)劑添加體積4 μL、灰化溫度1 100 ℃、原子化溫度2 200 ℃。加標(biāo)回收率為92.4%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.2%。試驗(yàn)結(jié)果表明GB 1903.21—2016適合測(cè)定富硒大蒜中有機(jī)Se，而DBS 42/002—2014不適合。富硒大蒜中總Se含量為7.541 μg/g，無(wú)機(jī)Se含量為1.256 μg/g，有機(jī)Se含量為6.285 μg/g，有機(jī)Se含量高達(dá)83.34%，這說(shuō)明富硒大蒜含有豐富的有機(jī)Se，是補(bǔ)Se良品。