那治國(guó) ，王紅梅，閆寶軍，張嵐，馬永強(qiáng)*

1. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部（哈爾濱 150066）；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150076）

米糠作為水稻制米的主要副產(chǎn)物，資源極其豐富，其中所含蛋白質(zhì)不僅必需氨基酸組成合理，效價(jià)較高，而且具有低過(guò)敏性等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的植物蛋白資源[1-3]。然而，由于米糠蛋白溶解性低，提取困難，且蛋白純度不高，尤其是高溫米糠粕蛋白過(guò)度變性，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，極大限制其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，至今沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4]。這與米糠蛋白復(fù)雜的組成成分密切相關(guān)，米糠中含有37%清蛋白、36%球蛋白、22%谷蛋白與5%醇溶蛋白，而且這些蛋白具有較強(qiáng)的聚合和大量二硫鍵，溶解性很差[5]。另一方面，為了防止米糠油脂酸敗而進(jìn)行的熱穩(wěn)定化處理可導(dǎo)致蛋白嚴(yán)重變性，蛋白交聯(lián)作用增加，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，溶解性等功能性質(zhì)下降[6]。由于米糠中膳食纖維和植酸含量較高，加劇米糠組分間的相互聚結(jié)，使蛋白很難分離。

前期研究表明，蒸汽閃爆（SFE）處理可有效提高高溫米糠粕中蛋白質(zhì)的提取率和氮溶解指數(shù)[7]。這主要是由于蒸汽閃爆處理使物料同時(shí)受到高溫蒸煮和蒸汽瞬間釋放所產(chǎn)生的機(jī)械剪切作用，一方面可使米糠細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，半纖維素降解，包裹鑲嵌其中的蛋白質(zhì)被釋放[8]；另一方面，這些作用勢(shì)必會(huì)引起高溫米糠粕中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的變化，進(jìn)而影響其溶解性等功能性質(zhì)[9-10]。另外，根據(jù)美拉德反應(yīng)的原理和特征可知，蒸汽閃爆過(guò)程中存在的高溫蒸煮作用可能會(huì)引起高溫米糠粕中的蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，蛋白質(zhì)分子極性增加，空間結(jié)構(gòu)變化，溶解性等功能性質(zhì)變化[11-12]。1988年Kato等[13]首次應(yīng)用干熱法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性，發(fā)現(xiàn)接枝物的溶解性、乳化性等功能特性均有很大改善，大量研究報(bào)道均證實(shí)蛋白質(zhì)糖基化改性能在一定程度上改善其功能性質(zhì)，但關(guān)于蒸汽閃爆對(duì)米糠粕美拉德反應(yīng)的研究尚屬空白。試驗(yàn)采用蒸汽閃爆技術(shù)對(duì)高溫米糠粕進(jìn)行處理，探討蒸汽閃爆對(duì)米糠蛋白美拉德反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步研究蒸汽閃爆對(duì)高溫米糠粕中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響提供理論基礎(chǔ)，并為開(kāi)發(fā)高溫米糠粕中蛋白質(zhì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫米糠粕（黑龍江省北大荒米業(yè)集團(tuán)有限公司），米糠在130 ℃、30 min濕熱穩(wěn)定化處理后，脫脂制成的粉末，其蛋白質(zhì)含量為18.23%，含水率10.3%。

2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；L-賴氨酸（分析對(duì)照品，上海吉至生化科技有限公司）；濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、溴化鉀、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、3, 5-二硝基水楊酸、葡萄糖（均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80蒸汽閃爆機(jī)（鶴壁市正道生物能源有限公司）；EA3000全自動(dòng)元素分析儀（意大利EuroVector儀器公司）；NR60CP手提式多功能色差儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司）；S433D全自動(dòng)氨基酸分析儀（德國(guó)Sykam公司）；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)BRUKER光譜儀器公司）；A11分析研磨機(jī)（德國(guó)IKA公司）；UDK152全制動(dòng)凱氏定氮儀（意大利VELP公司）；X18A鋁模塊自動(dòng)消化裝置（上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司）；PDU-1100冷凍干燥機(jī)（日本東京理化公司）；T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 方法

1.3.1 蒸汽閃爆處理

將高溫米糠粕粉碎，過(guò)60目篩，取400 g米糠粕粉放入蒸汽閃爆機(jī)的處理腔中，通入一定壓力的飽和蒸汽并保壓一定時(shí)間，在極短時(shí)間（ms）內(nèi)進(jìn)行蒸汽閃爆處理，收集閃爆樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 米糠蛋白質(zhì)的制備

稱取一定量的蒸汽閃爆處理前后的高溫米糠粕，按料液比1∶15加入蒸餾水混合，調(diào)節(jié)pH 9.0，在45℃水浴下攪拌浸提2 h后，以4 000 r/min離心15 min，收集上清液，20 ℃下調(diào)pH至4.6，靜置30 min，以4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，蒸餾水洗滌沉淀2次，相同方法離心，用去離子水溶解沉淀，調(diào)節(jié)pH 7.0，冷凍干燥后得到米糠蛋白。

1.3.3 蛋白質(zhì)得率、純度的測(cè)定

采用mico-Kjeldahl法測(cè)定米糠蛋白中蛋白質(zhì)含量，同時(shí)測(cè)定米糠粕中蛋白質(zhì)含量，按式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)得率，按式（2）計(jì)算米糠蛋白純度。

1.3.4 還原糖的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量蒸汽閃爆處理前后的高溫米糠粕，采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法[14]測(cè)定還原糖含量。

1.3.5 氮元素和碳元素的測(cè)定

采用意大利Euro Vector EA3000全自動(dòng)元素分析儀測(cè)定米糠蛋白中氮元素和碳元素含量。

1.3.6 米糠蛋白色澤的測(cè)定

采用手提式多功能色差儀測(cè)定米糠蛋白的色差值L*，a*，b*。

1.3.7 自由氨基的測(cè)定

參考Lertittikul等[15]的方法測(cè)定。稱取一定量米糠蛋白樣品，溶于0.1 g/100 mL SDS溶液中，配制質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL的蛋白質(zhì)溶液。取0.4 mL蛋白質(zhì)溶液，加入2 mL pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液和1 mL 0.1 g/100 mL TNBS試劑，振蕩混勻，在50 ℃水浴中避光反應(yīng)1 h后，加入2 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)，室溫下放置30 min后，以蒸餾水為空白，420 nm下測(cè)定吸光度。以L-賴氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中自由氨基含量。

1.3.8 氨基酸組成分析

精確移取一定量米糠蛋白樣品于水解管中，加入一定量的6 mol/L HCl溶液，密閉，110 ℃下水解24 h，冷卻，定容，過(guò)濾，干燥，加入一定量的0.02 mol/L HCl溶液，真空下放置30 min后加入氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定除色氨酸以外的其他氨基酸含量。

1.3.9 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析

參考齊軍茹等[16]的方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取適量干燥后樣品，加入一定量溴化鉀，研磨成均勻的粉末，壓成薄片，采用TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀作全波段（4 000～500 cm-1）掃描，掃描32 次。

1.3.10 熒光光譜分析

參考Li等[17]的方法測(cè)定。分別取各米糠蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0、0.01 mol/L），配置成1.0 mg/mL的溶液。熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為360～510 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，掃描速度10 nm/s。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件（p＜0.05表示差異顯著，p＞0.05表示差異不顯著）。傅里葉紅外光譜和熒光光譜采用Origin 8.0軟件作圖，其他采用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫米糠粕中還原糖含量變化

有研究表明，蒸汽壓力0.9～2.1 MPa、保壓時(shí)間90～210 s時(shí)，蒸汽閃爆處理高溫米糠粕能有效提高米糠蛋白的氮溶解指數(shù)[7]。因而，選擇0.9，1.5和2.1 MPa這3個(gè)蒸汽壓力，在90，150和210 s的保壓時(shí)間下進(jìn)行蒸汽閃爆，處理后的高溫米糠粕分別表示為：HTDDRB-0.9-150、HTDDRB-0.9-210、HTDDRB-1.5-90、HTDDRB-1.5-150、HTDDRB-2.1-90、HTDDRB-2.1-210，未處理的高溫米糠粕標(biāo)記為RHTDDRB，制備的米糠蛋白分別標(biāo)記為RBPI-0.9-150、RBPI-0.9-210、RBPI-1.5-90、RBPI-1.5-150、RBPI-2.1-90、RBPI-2.1-210，未處理的高溫米糠粕制備的米糠蛋白標(biāo)記為RBPI。

圖1為不同蒸汽閃爆條件處理后高溫米糠粕中還原糖含量變化。未處理的高溫米糠粕（RHTDDRB）中的還原糖含量?jī)H2.44%，蒸汽閃爆處理后還原糖含量顯著（p＜0.05）上升，且受蒸汽壓力和保壓時(shí)間影響較大，在2.1 MPa、210 s條件下，還原糖含量增至6.28%，與RHTDDRB相比提高1.57倍。有研究表明蒸汽閃爆可使米糠中的纖維組分在蒸汽蒸煮和機(jī)械剪切作用下部分降解為低分子的糖類[8]，從而導(dǎo)致高溫米糠粕中的還原糖含量上升。

圖1 蒸汽閃爆對(duì)高溫米糠粕中還原糖含量的影響

2.2 米糠蛋白得率、純度及氮碳元素含量變化

表1為高溫米糠粕經(jīng)不同蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白的得率、純度及氮元素和碳元素含量的變化情況。未經(jīng)蒸汽閃爆的高溫米糠粕制備的米糠蛋白的得率僅27.42%，而經(jīng)蒸汽閃爆處理后蛋白質(zhì)得率顯著升高（p＜0.05），最高可升至48.61%（RBPI-2.1-210）；且蛋白質(zhì)得率受蒸汽壓力影響顯著（p＜0.05），壓力從0.9 MPa上升到1.5 MPa時(shí)蛋白質(zhì)得率從35.23%（RBPI-0.9-150）提高到45.86%（RBPI-1.5-150），提高30.17%，壓力從1.5 MPa上升到2.1 MPa時(shí)蛋白質(zhì)得率從41.42%（RBPI-1.5-90）提高到46.50%（RBPI-2.1-90），提高了12.27%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在低壓下蛋白質(zhì)得率隨保壓時(shí)間的變化較大，在0.9 MPa下保壓時(shí)間從150 s升到210 s，蛋白質(zhì)得率提高10.28%，而在高壓下蛋白質(zhì)得率隨保壓時(shí)間的變化較小，在2.1 MPa下保壓時(shí)間從90 s升到210 s，蛋白質(zhì)得率僅提高4.54%。

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆后制備的蛋白的純度顯著下降（p＜0.05），最高降幅為10.27%（從83.65%降到75.06%），并且隨著蒸汽壓力的升高蛋白質(zhì)純度有所下降，保壓時(shí)間為210 s時(shí)蒸汽壓力從0.9 MPa上升到2.1 MPa，蛋白純度78.13%降至75.06%。結(jié)合蛋白質(zhì)得率的變化，可以發(fā)現(xiàn)，蒸汽閃爆處理雖然使蛋白純度下降，但蛋白質(zhì)的得率可以顯著增加（p＜0.05），同時(shí)在較高蒸汽壓力較短保壓時(shí)間（RBPI-2.1-90）和較低蒸汽壓力較長(zhǎng)保壓時(shí)間（RBPI-1.5-150）下，蛋白質(zhì)得率和純度變化均較小。

米糠蛋白純度的降低表明米糠蛋白中所含有的非蛋白質(zhì)類物質(zhì)增多[18]。因此，進(jìn)一步對(duì)米糠蛋白所含的氮元素和碳元素進(jìn)行測(cè)定，以探究蒸汽閃爆使蛋白純度降低的原因。從表1中的氮元素和碳元素含量變化中可以看出，高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后的米糠蛋白中氮元素含量顯著降低（p＜0.05），最高降幅26.65%（由15.27%降至11.20%），而碳元素的含量顯著增加（p＜0.05），最高升幅15.18%（由46.30%降至53.33%），且受蒸汽壓力和保壓時(shí)間的影響均較大。表明蒸汽閃爆處理后，米糠蛋白中氮元素含量較多的成分（如蛋白質(zhì)）相對(duì)降低而碳元素含量較高的成分（如糖類）相對(duì)升高，這可能是由于蒸汽閃爆過(guò)程中，高溫米糠粕中的蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中引入糖鏈，進(jìn)而使得蛋白中碳元素增加而氮元素相對(duì)降低，且米糠蛋白純度降低。

表1 不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下米糠蛋白的分析 %

2.3 米糠蛋白色澤變化

不同蒸汽閃爆處理前后的米糠蛋白的色差值L*，a*，b*見(jiàn)表2。高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后制備的米糠蛋白的L*值顯著降低（p＜0.05），最大降幅為35.58%，表明米糠蛋白的亮度降低，同時(shí)a*值顯著升高（p＜0.05），最高上升25.00%，表示紅色增加，且b*值顯著降低（p＜0.05），表示黃色降低，而藍(lán)色增加。米糠蛋白亮度（L*）的降低和紅色（a*）的增加表明蒸汽閃爆處理過(guò)程中發(fā)生了非酶褐變，即：美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)，而焦糖化反應(yīng)主要是由還原糖等低分子糖引起，淀粉等多糖不易發(fā)生焦糖化反應(yīng)[19]，由此可以判斷米糠蛋白的色澤變化很可能是由高溫米糠粕中的糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)在蒸汽閃爆的作用下發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成黑色的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物所引起的[20]。

表2 不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下米糠蛋白的色澤

2.4 自由氨基分析

高溫米糠粕中除了含20%左右的蛋白質(zhì)外，還含有膳食纖維、淀粉、低聚糖（棉籽糖、水蘇糖等）及還原糖等糖類物質(zhì)，在高溫作用下極易發(fā)生美拉德反應(yīng)，而美拉德反應(yīng)主要是基于蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基和糖分子還原末端的羰基之間的羰氨反應(yīng)[21]，歸屬于糖基化反應(yīng)。因而可通過(guò)分析米糠蛋白中自由氨基含量的變化來(lái)判斷蒸汽閃爆過(guò)程中是否伴有美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)，蒸汽壓力和保壓時(shí)間對(duì)米糠蛋白得率、純度、氮碳元素組成及色澤的影響較大，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇一個(gè)低壓長(zhǎng)時(shí)（0.9 MPa、210 s）、一個(gè)高壓短時(shí)（2.1 MPa、90 s）和一個(gè)高壓長(zhǎng)時(shí)（2.1 MPa、210 s）的蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下所得米糠蛋白為研究對(duì)象，與未經(jīng)蒸汽閃爆的高溫米糠粕制備的米糠蛋白進(jìn)行對(duì)比，研究蒸汽閃爆對(duì)高溫米糠粕中蛋白質(zhì)的自由氨基、氨基酸組、傅里葉紅外光譜和熒光性質(zhì)的影響。

圖2為不同蒸汽閃爆條件下所得米糠蛋白的自由氨基含量的變化情況。高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后，其米糠蛋白的自由氨基酸含量與未經(jīng)處理的米糠蛋白（RBPI）相比顯著下降（p＜0.05）。RBPI-0.9-210與RBPI-2.1-90的自由氨基含量相差不顯著（p＞0.05），而RBPI-0.9-210與RBPI-2.1-210，RBPI-2.1-90與RBPI-2.1-210的自由氨基含量具有顯著差別（p＜0.05）。表明蒸汽壓力和保壓時(shí)間對(duì)米糠蛋白的自由氨基含量影響較大，自由氨基含量隨蒸汽壓力的增大和保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中，RBPI-2.1-210的自由氨基含量最低為0.47 mmol/g，與RBPI的自由氨基含量（0.75 mmol/g）相比降低37.33%。另外，低壓長(zhǎng)時(shí)和高壓短時(shí)的蒸汽閃爆條件對(duì)米糠蛋白自由氨基含量的影響不大。根據(jù)美拉德反應(yīng)原理，米糠蛋白自由氨基含量的減少表明高溫米糠粕中的蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)一步驗(yàn)證米糠蛋白的純度、氮碳元素組成及色澤變化的結(jié)果。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白中的自由氨基顯著降低，引發(fā)了糖基化反應(yīng)；Xia等[23]在采用噴射蒸煮處理制備高溫米糠分離蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)處理后的米糠蛋白自由氨基明顯減少，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 氨基酸組成分析

由試驗(yàn)可知，蒸汽閃爆處理過(guò)程可促使高溫米糠粕中的蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，造成米糠蛋白中的自由氨基減少。蛋白質(zhì)的自由氨基包括末端的α-氨基和側(cè)鏈的ε-氨基，為進(jìn)一步研究糖類物質(zhì)與米糠蛋白的結(jié)合部位，對(duì)不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下制備的米糠蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，蒸汽閃爆處理后米糠蛋白中的精氨酸和賴氨酸含量與未處理的對(duì)照樣相比顯著降低（p＜0.05），Xia等[23]在采用噴射蒸煮處理米糠粕的研究中發(fā)現(xiàn)，處理后的米糠蛋白的精氨酸和賴氨酸含量顯著降低，表明精氨酸和賴氨酸可能參與美拉德反應(yīng)，Guan等[24]在研究微波合成大豆蛋白—糖接枝物時(shí)也得出同樣結(jié)論。由于精氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈上存在自由氨基，可以與糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，可以確定米糠蛋白中的精氨酸和賴氨酸在蒸汽閃爆的作用下與糖分子發(fā)生美拉德反應(yīng)，使其含量降低。由表3還可發(fā)現(xiàn)，精氨酸和賴氨酸的含量隨著蒸汽壓力和保壓時(shí)間的升高而降低，在蒸汽壓力0.9 MPa時(shí)精氨酸和賴氨酸含量分別為10.56%和3.57%（RBPI-0.9-210），而在蒸汽壓力提高到2.1 MPa時(shí)其含量分別降為9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），同時(shí)在較高蒸汽壓力下（2.1 MPa）精氨酸和賴氨酸含量隨保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，由9.66%和3.12%（RBPI-2.1-90）降到9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），表明蒸汽閃爆處理時(shí)高壓和長(zhǎng)時(shí)有利于精氨酸和賴氨酸參與美拉德反應(yīng)。

表3 不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下米糠蛋白的氨基酸組成g/100 g蛋白質(zhì)

2.6 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析

傅里葉紅外光譜（FTIR）除了可用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析外[25]，經(jīng)常被用于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分析[26]。蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合即美拉德反應(yīng)，可使蛋白質(zhì)分子引入糖鏈，羥基增多，因而在3 700～3 200 cm-1（O—H和N—H的伸縮振動(dòng)峰）和1 260～1 000 cm-1（—C—O—O糖苷鍵的伸縮振動(dòng)）處的紅外吸收增強(qiáng)[26]。對(duì)米糠蛋白進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下米糠蛋白的傅里葉紅外光譜

高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后，其米糠蛋白在3 700～3 200 cm-1處的紅外吸收增強(qiáng)，其中，3 427 cm-1處的吸收強(qiáng)度增加最為顯著，同時(shí)1 260～1 000 cm-1處的吸收也明顯增加，并且增加的幅度受蒸汽壓力和保壓時(shí)間的影響較大，在2.1 MPa、210 s蒸汽閃爆條件下增加最為顯著。表明高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆后，其蛋白分子上引入糖苷鍵，羥基增加，這進(jìn)一步證明蒸汽閃爆過(guò)程中米糠蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合糖類物質(zhì)，生成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

2.7 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光光譜分析

美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的褐色物的前體物質(zhì)具有典型的熒光特征，可作為美拉德反應(yīng)的指示劑[27-28]，因此可通過(guò)米糠蛋白糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度和光譜特征來(lái)研究美拉德反應(yīng)的程度。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)一般為340～370 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)一般為420～440 nm。采用340 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)蒸汽閃爆處理前后制備的米糠蛋白進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖4所示。

高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后制備的米糠分白的熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度都發(fā)生較大變化。原高溫米糠粕制備的蛋白在440 nm處有最大熒光強(qiáng)度，而不同條件的蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白分別在422，430和430 nm處有最大熒光強(qiáng)度，符合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特征，且熒光強(qiáng)度均大幅度提高，進(jìn)一步證實(shí)蒸汽閃爆處理過(guò)程中美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

從圖4中還看出，隨著蒸汽壓力增加或保壓時(shí)間延長(zhǎng)，米糠蛋白的熒光強(qiáng)度明顯減弱，這主要與美拉德反應(yīng)的進(jìn)行程度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，熒光物質(zhì)是類黑素的前體物，且熒光物質(zhì)所需要的誘導(dǎo)時(shí)間較短[17]，因此當(dāng)蒸汽壓力增大或保壓時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，會(huì)有更多前期產(chǎn)生的熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轭伾镔|(zhì)，使熒光強(qiáng)度降低。因此蒸汽壓力和保壓時(shí)間可影響美拉德反應(yīng)進(jìn)程，這也可從米糠蛋白顏色變深得到驗(yàn)證（見(jiàn)表2）。

圖4 不同蒸汽閃爆處理?xiàng)l件下米糠蛋白糖基化產(chǎn)物熒光光譜圖

3 結(jié)論

蒸汽閃爆處理可顯著提高高溫米糠粕中的還原糖含量和蛋白質(zhì)得率，但同時(shí)蛋白純度出現(xiàn)不同程度降低，通過(guò)氮碳元素分析發(fā)現(xiàn)，其碳元素相對(duì)含量增加，米糠蛋白中引入碳元素含量較高的物質(zhì)。蒸汽閃爆處理后所得米糠蛋白的色澤變深變暗，蛋白質(zhì)的自由氨基及精氨酸和賴氨酸相對(duì)含量顯著下降，傅里葉紅外光譜顯示蛋白質(zhì)分子上引入糖苷鍵，表明高溫米糠粕經(jīng)蒸汽閃爆處理后，蛋白質(zhì)中精氨酸和賴氨酸的自由氨基與糖分子的游離羰基發(fā)生美拉德反應(yīng)，熒光光譜分析證實(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的存在，且反應(yīng)進(jìn)程受蒸汽壓力和保壓時(shí)間的影響顯著。