張 琪 汪 穎

(北京市神經(jīng)外科研究所電鏡室 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100070)

脊索瘤是一種較為少見的低中度惡性原發(fā)性骨腫瘤，起源于胚胎殘余脊索組織[1]。男性略多于女性，發(fā)病年齡不等，尤30歲以后發(fā)病多見。脊索瘤以局部侵襲性及高復發(fā)性為特點，治療上以手術(shù)治療為主，對傳統(tǒng)的放化療均不敏感?；颊咝g(shù)后腫瘤復發(fā)率相對較高，預后也較差。顱底脊索瘤好發(fā)于斜坡區(qū)，常以顱神經(jīng)損害(其中以動眼神經(jīng)和外展神經(jīng)癥狀多見)腦積水和運動感覺障礙起病，因起病隱匿，無典型癥狀而導致診斷延遲。本研究從形態(tài)學角度分析，對脊索瘤的組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進行觀察，從而輔助脊索瘤的臨床診斷，進一步指導臨床合理制訂治療方案，并判斷預后。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院北京市神經(jīng)外科研究所超微形態(tài)室2012年至2019年間診斷為脊索瘤的241例患者，其中男性141例(59%)，女性100例(41%)。年齡發(fā)生在3～80歲，平均年齡為43歲。241例標本中有227例經(jīng)典型脊索瘤，14例軟骨樣脊索瘤?；颊呤自\的主要臨床表現(xiàn)為頭痛及復視，其他癥狀還包括吞咽困難、飲水嗆咳、言語不清、構(gòu)音不良、視物模糊、行走不穩(wěn)及面神經(jīng)癱瘓等。神經(jīng)學檢查為多組腦神經(jīng)受累的相應體征，如眼球運動受限、水平眼震、突眼、舌肌萎縮、舌肌纖顫、淺感覺減退、眼瞼下垂和咽反射遲鈍等。

1.2 標本制備及儀器

電鏡標本制備：將手術(shù)中切除的脊索瘤標本即刻置入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中固定，0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(pH=7.4)沖洗；再經(jīng)1%四氧化鋨后固定，雙蒸水沖洗后，梯度乙醇脫水至環(huán)氧丙烷，SPI812樹脂包埋；使用Leica EM UC7切片機制備1μ半薄切片，天青-美藍染色光學顯微鏡觀察定位后，Leica EM UC7切片機制備60nm超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，HITACHI H-7650型透射電子顯微鏡觀察、拍片。

1.3 結(jié)果判定

每例標本分別觀察腫瘤細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，瘤細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布，瘤細胞膜表面突起及細胞間連接，瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體等細胞器分布，細胞間質(zhì)有無絮狀無定形結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本組241例患者，男141例，女100例，男女比例約為1.41∶1。年齡范圍在3～80歲，平均43歲。病程1月～7年。臨床主要表現(xiàn)為頭痛，復視，面神經(jīng)癱瘓等。241例患者均行CT(SENSATION, Siemens, 德國)或MRI (Tiro3.0T, Prisma, Siemens, 德國)影像學檢查，病變部位累及斜坡者占85%(206/241)，表明顱底脊索瘤發(fā)病的典型位置。顱底由于結(jié)構(gòu)相對復雜，顱底脊索瘤一般生長緩慢，較易侵犯鄰近顱底的重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)完全切除的難度相對較大，且容易殘留引起腫瘤復發(fā)。本組241例中46例僅局限于斜坡區(qū)(19%)，余195例均伴有周圍組織結(jié)構(gòu)的侵犯和不同程序的組織破壞(81%)，顯示了脊索瘤較易影響周圍結(jié)構(gòu)的這一特征。

頭部平掃+增強MRI檢查結(jié)果如圖1所示，右額鞍背，斜坡骨質(zhì)破壞，術(shù)區(qū)信號混雜，局部可見梭形混雜密度，斜坡，鞍區(qū)可見團塊狀混雜信號影，邊緣不清(見圖1A)，左側(cè)基底節(jié)區(qū)可見片狀長T1和長T2信號(箭頭所示長T2信號)，邊緣模糊，增強可見中度不均勻強化(見圖1B)。

圖1 頭顱MRI檢查影像

2.2 病理形態(tài)及免疫組織化學特征

241例脊索瘤組織均行天青-美蘭半薄切片染色和免疫組織化學染色。按照瘤細胞的分布程度，光鏡(Leica DM4000)下觀察到的脊索瘤分為密集型和稀疏型兩種，密集型脊索瘤瘤細胞排列緊密，細胞數(shù)量較多，細胞之間未見絮狀無定形物質(zhì)，細胞核形態(tài)相對規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，核仁大且明顯，雙核仁多見，偶見瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)空泡狀物質(zhì)，間質(zhì)散在血管結(jié)構(gòu)(見圖2A～圖2B)。稀疏型脊索瘤瘤細胞分布較稀疏，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的空泡將胞核擠至細胞一側(cè)，胞核形態(tài)不規(guī)則，胞膜表面突起豐富(見圖2C)，部分瘤組織內(nèi)可見鈣化灶及大量炎細胞浸潤(見圖2D)。特殊染色PAS,alcian blue(阿辛藍)著色，瘤細胞胞漿和細胞外基質(zhì)均陽性表達。表1顯示241例脊索瘤標本均進行免疫組織化學染色，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)，低分子細胞角蛋白(CAM5.2), 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)均呈陰性表達，增殖細胞相關核抗原(Ki-67)增殖指數(shù)為10%～20%。其中227例經(jīng)典型脊索瘤組織中細胞角蛋白(CK)表達陽性者227例，上皮膜抗原(EMA)表達陽性者210例，波形蛋白(Vimentin)表達陽性者224例， S-100表達陽性者192例，胚胎核轉(zhuǎn)錄蛋白(Brachyury)表達陽性者225例，另外14例軟骨樣脊索瘤組織中CK表達陽性者14例，EMA表達陽性者11例， Vimentin表達陽性者14例， S-100表達陽性者14例， Brachyury表達陽性者14例。

圖2 脊索瘤病理形態(tài)

表1 脊索瘤免疫組織化學染色陽性結(jié)果 例

2.3 透射電鏡觀察

241例脊索瘤臨床樣本進行電鏡下觀察，其中經(jīng)典型脊索瘤227例，軟骨樣脊索瘤14例。經(jīng)典型脊索瘤患者中大部分組織瘤細胞稀疏分布(見圖3A～圖3F)，另外一部分患者組織中瘤細胞分布相對密集(見圖3G～圖3I)。稀疏分布的瘤組織中瘤細胞比較大，形態(tài)不規(guī)則(見圖3A)，細胞核常被黏液泡擠至一側(cè)呈偏位，細胞核形態(tài)不規(guī)則，核仁明顯，細胞膜表面可見微絨毛樣細長或短小粗鈍的突起(見圖3B)，細胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的空泡和微絲樣結(jié)構(gòu)，空泡內(nèi)可見纖維狀物或無定形絮狀蛋白樣物質(zhì)，相鄰細胞膜之間可見不典型的橋粒連接(見圖3C)，沿細胞膜表面有大量吞飲小泡(見圖3D)，部分瘤細胞質(zhì)內(nèi)散在糖原顆粒。瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)可見典型的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包繞線粒體(線粒體-RER)形成的特征性結(jié)構(gòu)(見圖3E)，間質(zhì)散在大量絮狀無定形物質(zhì)(見圖3F)。分布相對密集的瘤組織內(nèi)瘤細胞核大漿少，胞核異型，部分組織中散在大量炎細胞浸潤(見圖3G)，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體-RER典型結(jié)構(gòu)(見圖3H)和大量微絲(見圖3I)。軟骨樣脊索瘤樣本中少部分患者瘤細胞分布相對密集，大部分稀疏分布，在細胞膜表面無特殊的細胞間連接，僅存在少量微絨毛樣短小突起(見圖4A)，胞質(zhì)內(nèi)見大量糖原及微絲(見圖4B)，此型組織除了線粒體-RER結(jié)構(gòu)外(見圖4C)，還可觀察到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)存在微管樣結(jié)構(gòu)(見圖4D)，這是軟骨樣脊索瘤電鏡下的主要超微結(jié)構(gòu)特點。

圖3 經(jīng)典型脊索瘤

圖4 軟骨樣脊索瘤

3 討論

脊索瘤是罕見的原始脊索殘余發(fā)生的惡性腫瘤，僅占骨原發(fā)惡性腫瘤的4%，幾乎只發(fā)生在中軸部位，尤其是脊柱的兩端。脊索瘤依據(jù)腫瘤細胞分化程度和形態(tài)學特點分為3個亞型：經(jīng)典型，軟骨型，去分化型。目前對脊索瘤發(fā)生機制的認識尚有限[1,2]。研究報道，男性患者較常見，發(fā)病部位與脊索殘存部位有關，易發(fā)生于脊柱兩端，但較少發(fā)生于鼻咽部及頸椎[3,4]。本組病例主要以男性患者及顱底部位發(fā)病為主。經(jīng)典型較多見，占227例，光鏡下腫瘤呈分葉狀，瘤細胞呈條索狀排列，胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的空泡，呈典型的“液滴樣”細胞，核分裂影像較少見，背景為黏液樣基質(zhì)。軟骨樣脊索瘤14例，在瘤組織內(nèi)既有經(jīng)典型脊索瘤的結(jié)構(gòu)，又有向軟骨方向分化的表現(xiàn)，易誤診為軟骨肉瘤，這是一種特殊類型的脊索瘤，占脊索瘤的5%～15%。本組病例未收集分化型脊索瘤。分化型較少見，占脊索瘤比例<10%，除了經(jīng)典型脊索瘤形態(tài)特點外，局灶還會出現(xiàn)低分化肉瘤樣區(qū)域以及不同成分之間的移行區(qū)，侵襲性強，預后差。

脊索瘤診斷需要綜合考慮患者的病史、癥狀、體征、輔助檢查以及術(shù)后病理等進行判斷[5]。雖然臨床上初步診斷主要依靠影像學診斷(CT /MRI)，但最終確診還需要通過腫瘤切除術(shù)或活檢術(shù)獲取標本進行病理學診斷加以明確[6]。光鏡、免疫組化及電鏡三個方面對于脊索瘤的診斷、療效及預后判定是互補的, 單純依靠光鏡和免疫組化, 資料有限，需要電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)進行協(xié)助；單純依靠電鏡難以避免以點蓋面的不足，實際工作中需結(jié)合常規(guī)光鏡病理觀察，提供更為完整的腫瘤形態(tài)學資料。

脊索瘤患者的臨床癥狀與其發(fā)生部位存在密切關系，主要癥狀為病灶部位疼痛及神經(jīng)功能障礙或缺損。本組241例患者就診的主要臨床表現(xiàn)包括無誘因頭暈或頭疼、視力下降，行走不穩(wěn)，飲水嗆咳，間歇性吞咽困難，發(fā)作性抽搐，周圍組織麻木、大小便潴留、鼻塞及鼻出血，結(jié)合影像學檢查確定發(fā)病部位，當患者出現(xiàn)上述癥狀，應高度懷疑脊索瘤的可能性。

X片、CT及MRI檢查是目前的主要影像學檢查手段，其中CT與MRI是目前主要的參考手段，尤其是MRI檢查，參考價值較大[7-9]。本組241例患者中46例僅局限于斜坡區(qū)(19%)，余195例均伴有周圍組織結(jié)構(gòu)的侵犯和不同程序的組織破壞(81%)，顯示了脊索瘤較易影響周圍結(jié)構(gòu)的這一特征。但有文獻報道，病理與影像學檢查的相符率僅有50%，提示影像學檢查診斷該病存在局限性[10，11]。

病理學診斷是脊索瘤診斷的“金標準”。 對脊索瘤進行分子生物學標記是現(xiàn)代診斷病理學的重要步驟之一，同時必須清楚現(xiàn)有生物學標志物并不是特異或?qū)ｉT針對某一種類腫瘤。細胞角蛋白(cytokeratin CK)主要分布于上皮細胞，是角質(zhì)細胞中的主要骨架蛋白，這種結(jié)構(gòu)蛋白主要維持上皮組織的完整性及連續(xù)性，陽性表達于上皮細胞，間質(zhì)細胞[12]。上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)廣泛分布于各種上皮細胞及其來源的腫瘤中，分布范圍與細胞角蛋白相似，用于研究上皮及上皮源性腫瘤[13]。波形蛋白(Vimentin)是中間絲的其中一種蛋白質(zhì)，組成細胞骨架，參與微管及肌動蛋白微細絲形成，是間葉組織標志[14]。 膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是膠質(zhì)細胞特有的一種中間絲蛋白，廣泛分布于星形膠質(zhì)細胞質(zhì)和突起內(nèi)，其陽性表達在具有向星形膠質(zhì)細胞分化特征的膠質(zhì)瘤及60%～70%的少枝膠質(zhì)細胞瘤[15]。S-100蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部的星狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中[16]。

本組241例腫瘤均行免疫組織化學染色，結(jié)果顯示241例中GFAP蛋白均陰性表達，20例EMA陰性表達，3例Vimentin陰性表達，35例S-100陰性表達，僅2例Brachyury陰性表達，Ki-67增殖指數(shù)為10%～20%，余均表達陽性。由于和脊索瘤組織學相似的腫瘤類型有很多，而免疫組化抗體Vimentin、CK、EMA、S-100及Ki-67特異性并不高，使得脊索瘤的誤診率較高。Brachyury基因是近年來發(fā)現(xiàn)對脊索瘤高度敏感和特異的基因，2013版WHO骨與軟組織腫瘤分類中明確提出Brachyury抗體可以輔助脊索瘤診斷，該項免疫組化檢測已經(jīng)常規(guī)應用于臨床診斷工作中[17]。盡管有文獻已經(jīng)報道，作為診斷脊索瘤的一線抗體，Brachyury的敏感性和特異性均較好，但也存在部分患者Brachyury陰性表達的可能性[18，19]，因此，利用電鏡技術(shù)更容易對部分脊索瘤類型進行定性，進而輔助疾病的診斷。

進一步對241例脊索瘤進行超微結(jié)構(gòu)診斷，經(jīng)典型脊索瘤227例中62例瘤細胞呈密集分布，165例呈稀疏分布，軟骨樣脊索瘤14例中2例呈密集分布，12例呈稀疏分布。通過觀察腫瘤超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，稀疏分布的瘤細胞體積較大，胞核形態(tài)不規(guī)則，細胞核常被黏液泡擠至一側(cè)呈偏位，細胞膜表面可見微絨毛樣細長或短小粗鈍的突起，細胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的空泡和微絲樣結(jié)構(gòu)，空泡內(nèi)可見纖維狀物或無定形絮狀蛋白樣物質(zhì)，相鄰細胞膜之間可見不典型的橋粒連接，表明其具有上皮性質(zhì)。沿細胞膜表面有大量吞飲小泡，部分瘤細胞質(zhì)內(nèi)散在糖原顆粒，最典型的特征性結(jié)構(gòu)是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包繞線粒體形成的“線粒體-RER”結(jié)構(gòu)。密集分布的瘤細胞呈核大漿少，部分組織中散在炎細胞浸潤，也可見“線粒體-RER”典型結(jié)構(gòu)。軟骨樣脊索瘤瘤細胞膜表面無特殊的細胞間連接，僅存在少量微絨毛樣短小突起，胞質(zhì)內(nèi)也可見大量糖原及微絲，除了“線粒體-RER”結(jié)構(gòu)外，還可觀察到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)存在微管樣結(jié)構(gòu)，這是電鏡下區(qū)別軟骨樣脊索瘤與經(jīng)典型脊索瘤的最主要特征。研究已經(jīng)證實，軟骨樣脊索瘤較普通型脊索瘤預后好[6, 20，21]，因此電鏡下區(qū)別兩型腫瘤，有利于評估患者愈后情況。

綜上所述，脊索瘤為低度惡性的局部侵襲性腫瘤，好發(fā)于顱底、骶骨及脊柱，目前臨床上完全切除難度較高，且復發(fā)率較高。患者診斷主要結(jié)合病史、癥狀、體征、影像學特征、病理形態(tài)，免疫組織化學染色和超微結(jié)構(gòu)特征，治療以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放療等綜合治療。形態(tài)學檢查中光鏡、免疫組化及電鏡三者在脊索瘤的基礎研究、診斷、療效與副反應觀察及預后判定中的作用是互補的。

透射電鏡下觀察脊索瘤超微形態(tài)能夠更加直觀的區(qū)別腫瘤的不同分型，彌補光鏡病理診斷的不足之處，從而更好的輔助脊索瘤的臨床診斷，評估患者愈后。