張晶晶，彭銳，杜春貴，滑亞婷，黃秋麗，姚瀟翎

(浙江農(nóng)林大學(xué) 工程學(xué)院，杭州 311300)

食品安全問題已經(jīng)是一個(gè)全世界都關(guān)注的問題，其中真菌及其產(chǎn)生的次級(jí)代謝物真菌毒素引起的食品安全問題日益嚴(yán)重[1]。據(jù)報(bào)道，每年約有10億噸農(nóng)業(yè)產(chǎn)品受到真菌及真菌毒素的污染[2]，導(dǎo)致了資源和經(jīng)濟(jì)的損失，而且由于真菌毒素極強(qiáng)的急性毒性、致畸性、致癌性、致突變性等，將會(huì)對(duì)人類的身體健康和生命安全造成嚴(yán)重威脅[3]。因此，亟待大力研發(fā)防霉劑，解決真菌霉變問題。目前，國(guó)內(nèi)外研發(fā)的食品防霉劑大多為化學(xué)藥劑，雖然防霉效果好，但由于化學(xué)抗菌劑的安全性受到挑戰(zhàn)，天然抗菌物憑借著具有化學(xué)合成劑無法比擬的安全優(yōu)勢(shì)，越來越被推崇[4-6]。因此，研發(fā)新型環(huán)保防霉劑取代化學(xué)防霉劑將成為必然。

近年來，由于植物源性防霉劑具有抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣、對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人體相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為植物性天然抗菌劑研究的熱點(diǎn)，其中，關(guān)注較多的是一些具有較強(qiáng)抗菌防霉活性的中草藥。作為中藥山蒼子精油主要成分的檸檬醛，因具有較強(qiáng)的抑菌性能[7]，目前正在引起學(xué)者的研究興趣。且我國(guó)的中藥山蒼子精油產(chǎn)量居世界第一，故研制檸檬醛類抗菌劑，來源廣、成本低、綠色、安全，必將有著廣闊的研發(fā)與應(yīng)用前景。為此，本文綜述了近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)檸檬醛抑菌性能、抑菌機(jī)理等的研究進(jìn)展，并對(duì)其在食品霉菌防治中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，可為檸檬醛在食品領(lǐng)域中的抗菌防霉研究與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 檸檬醛對(duì)青霉菌的抑制作用

青霉菌是青霉屬真菌的一種，極易侵染柑橘等物質(zhì)導(dǎo)致其霉變腐爛[8]。目前，有少量檸檬醛對(duì)青霉菌抑制的相關(guān)研究報(bào)道。

1.1 檸檬醛對(duì)青霉菌細(xì)胞形態(tài)的影響

Tao等[9,10]通過對(duì)柑桔精油和檸檬醛對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抗真菌活性以及抗真菌作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)檸檬醛可以通過引起細(xì)胞質(zhì)的丟失，以及菌絲的變形而明顯改變意大利青霉菌菌絲的形態(tài)。檸檬醛對(duì)意大利青霉形態(tài)影響的掃描電鏡(SEM)見圖1。

圖1 檸檬醛對(duì)意大利青霉菌絲體形態(tài)的影響Fig.1 Effect of citral on the morphology of Penicillium italicum mycelium

由圖1可知，未經(jīng)檸檬醛處理的對(duì)照菌的菌絲正常、管狀、規(guī)則、均質(zhì)(見圖1中 a)。經(jīng)檸檬醛最小抑菌濃度(MIC)處理4 d后，意大利青霉菌的菌絲表面呈疣狀(見圖1中b)。而經(jīng)檸檬醛最小殺菌濃度(MFC)處理4 d后，意大利青霉菌的菌絲因缺乏細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重塌陷(見圖1中c和d)，且菌絲萎縮變形(見圖1中c)。

為了進(jìn)一步闡明檸檬醛的殺傷機(jī)制，Tao采用透射電鏡(TEM)對(duì)經(jīng)MIC和MFC處理的青霉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖2。

圖2 檸檬醛對(duì)意大利青霉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of citral on cellular ultrastructure of Penicillium italicum

由圖2可知，未經(jīng)檸檬醛處理的意大利青霉菌的細(xì)胞表面光滑致密(見圖2中a)，而經(jīng)檸檬醛處理后的意大利青霉菌的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化 (見圖2中b和c)。其中，檸檬醛MIC明顯誘導(dǎo)了菌絲抑制的形成(見圖2中b)，而檸檬醛MFC則破壞了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)丟失，大量物質(zhì)從細(xì)胞壁外擠壓而出(見圖2中c)。

1.2 檸檬醛對(duì)青霉菌細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)成分的影響

陶能國(guó)等[11,12]研究表明檸檬醛處理可導(dǎo)致細(xì)胞總MDA和H2O2增加(見圖3)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，細(xì)胞的總脂質(zhì)和麥角甾醇含量降低(見圖4)，從而誘導(dǎo)青霉菌絲體發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過氧化損傷，增加細(xì)胞膜通透性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，達(dá)到抑制青霉菌生長(zhǎng)的作用。

圖3 檸檬醛對(duì)指狀青霉總MDA和H2O2含量的影響Fig.3 Effect of citral on the total MDA and H2O2 content of Penicillium digitatum

圖4 檸檬醛對(duì)意大利青霉細(xì)胞總脂質(zhì)含量(a)和麥角甾醇含量(b)的影響Fig.4 Effect of citral on the total lipid content (a) and ergosterol content (b) of Penicillium italicum cells

同時(shí)陶能國(guó)、歐陽(yáng)秋麗等[13]的研究表明，檸檬醛既能破壞青霉菌細(xì)胞膜，又會(huì)影響青霉菌的一些代謝途徑，從而使細(xì)胞不能進(jìn)行正常生命活動(dòng)。檸檬醛對(duì)青霉菌起破壞作用的方式主要有：(1)檸檬醛能通過大量積累活性氧破壞指狀霉菌的氧化磷酸化和細(xì)胞膜，抑制指狀霉菌的生長(zhǎng)；(2)通過破壞指狀青霉線粒體外膜和內(nèi)膜，改變其選擇通透性，從而影響線粒體內(nèi)外物質(zhì)的輸送；(3)通過降低呼吸代謝對(duì)氧的利用率，從而使 ATP 含量減少；(4)通過直接影響糖酵解途徑(如改變指狀青霉糖酵解途徑關(guān)鍵酶的活性，見圖5)、重要中間產(chǎn)物的含量和TCA途徑。

圖5 檸檬醛對(duì)指狀青霉丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)活性的影響Fig.5 Effect of citral on PK，PFK，HK activity of Penicillium digitatum

綜上所述，檸檬醛處理青霉菌后，不僅改變了青霉菌菌絲形態(tài)、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)，而且破壞了細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜通透性以及細(xì)胞代謝途徑，從而起到抑菌作用。

2 檸檬醛對(duì)曲霉菌的抑制作用

曲霉菌是廣泛存在于自然界中的一種深部條件致病性絲狀真菌[14]。有的能產(chǎn)生對(duì)人體有害的真菌毒素，有的則引起水果、蔬菜、糧食霉腐。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)利用防霉劑殺死曲霉菌進(jìn)行了大量研究，其中有部分檸檬醛作為殺菌劑的相關(guān)研究報(bào)道。

2.1 檸檬醛對(duì)曲霉菌細(xì)胞形態(tài)的影響

研究表明[15-17]用檸檬醛處理曲霉后，曲霉會(huì)發(fā)生以下變化：菌絲扭曲、欲折、分枝少；分生孢子梗萎縮，表面光滑；細(xì)胞體積減小，表面凹陷，細(xì)胞壁厚度減小，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞漿的缺損和疏松，線粒體解體，不規(guī)則線粒體數(shù)量增多并聚集等。

羅曼等[18]采用檸檬醛蒸汽與溶液對(duì)黃曲霉孢子進(jìn)行處理，并通過透射電鏡觀察了黃曲霉孢子的顯微結(jié)構(gòu)變化。檸檬醛蒸汽對(duì)黃曲霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響見圖6。

圖6 黃曲霉孢子經(jīng)檸檬醛同分異構(gòu)體蒸汽處理后透射電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer steam treatment under TEM

由圖6可知，孢子細(xì)胞壁形態(tài)變化不明顯，細(xì)胞漿內(nèi)物質(zhì)聚集明顯。與對(duì)照組比較，處理組細(xì)胞壁變薄且凹凸不平，部分區(qū)域皺縮；但周質(zhì)空間(細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞之間的空隙)的電子密度沒有明顯改變。此外，處理組胞漿內(nèi)物質(zhì)也明顯不如對(duì)照組的分布均勻，有區(qū)域化聚集趨勢(shì)。檸檬醛溶液處理對(duì)黃曲霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響見圖7。

圖7 黃曲霉孢子經(jīng)檸檬醛同分異構(gòu)體溶液處理后透射電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer solution treatment under TEM

由圖7可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)過檸檬醛溶液處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞壁嚴(yán)重皺縮并多處突起；周質(zhì)空間的電子密度大大增強(qiáng)，細(xì)胞膜清晰且在部分區(qū)域出現(xiàn)與胞質(zhì)分離現(xiàn)象；細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的固縮化，出現(xiàn)不規(guī)則的固形物。

2.2 檸檬醛對(duì)曲霉菌細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)成分的影響

研究表明檸檬醛處理曲霉能改變其膜的物理參數(shù)(見表1)[19]，進(jìn)而改變其質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)。蔣立科等[20]研究了檸檬醛作用于曲霉的動(dòng)靜態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)該醛能使黃曲霉中的有些大分子失去正常結(jié)構(gòu)，改變其功能，影響相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而殺死曲霉。

表1 受損黑曲霉質(zhì)膜的粘彈性參數(shù)Table 1 The viscoelasticity parameters of damaged Aspergillus niger plasmalemma

吳子健等[21]研究表明檸檬醛處理會(huì)破壞曲霉氧化還原系統(tǒng)和細(xì)胞能量代謝途徑，如可以通過降低黃曲霉細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(SDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活力(見表2和表3)影響曲霉的TCA循環(huán)，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞能量代謝途徑。

表2 檸檬醛對(duì)SDH活力的影響Table 2 The effect of citral on SDH activity

表3 檸檬醛對(duì)胞液內(nèi) MDH 活力的影響(以 NADP+為輔酶)Table 3 The effect of citral on MDH activity in cytosol (with NADP+ as coenzyme)

也有研究表明檸檬醛會(huì)使細(xì)胞內(nèi)Ca2+、K+、Mg2+滲漏量增加，總脂質(zhì)含量下降，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸增加，并影響曲霉菌的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，見表4。

表4 檸檬醛對(duì)曲霉菌3種同位素標(biāo)記前體摻入抑制率Table 4 Inhibition rate of citral on three isotope labeled precursors of Aspergillus

綜上所述，檸檬醛處理曲霉菌后，不僅改變了曲霉菌菌絲形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)，而且破壞了細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜通透性、膜的物理參數(shù)以及細(xì)胞代謝途徑，從而起到抑制曲霉的作用。

3 檸檬醛對(duì)木霉菌的抑制作用

木霉菌是食用菌生產(chǎn)中一個(gè)主要的競(jìng)爭(zhēng)性雜菌和病原菌[22]，不僅會(huì)導(dǎo)致食用菌已滅菌培養(yǎng)料或發(fā)酵料受到污染，而且感染雙孢蘑菇、平菇等菌絲體，引起菌袋或菌棒中菌絲體凋亡，造成極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[23-25]。目前，有少量檸檬醛對(duì)木霉菌抑制作用的研究報(bào)道。

林群英等[26]對(duì)4種植物精油抑制黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、綠色木霉和木霉等病原真菌的效果進(jìn)行分析，并以金針菇為材料進(jìn)行初步保鮮效果評(píng)價(jià)。研究結(jié)果顯示：檸檬醛對(duì)產(chǎn)黃青霉及木霉的抑制率最高。郭丹等[27]通過對(duì)山蒼子油主成分檸檬醛、香茅醛及其衍生物共 10種化合物對(duì)綠色木霉抑制活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這些化合物對(duì)綠色木霉有一定的抑制作用。而且經(jīng)化合物處理后，菌液相對(duì)滲透率均有所增大，說明上述化合物造成菌體細(xì)胞膜的破壞是其抑菌作用原因之一。

4 檸檬醛對(duì)其他真菌的抑制作用

目前，有關(guān)檸檬醛對(duì)真菌抑制作用的研究，主要集中在上述3種真菌上。除此之外，還有少數(shù)有關(guān)犬白色念珠菌、白假絲酵母等真菌的研究。

孫博等[28]對(duì)肉桂醛、檸檬醛在真菌黏附口腔黏膜上皮以及對(duì)犬白色念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行探索。結(jié)果表明，藥物處理后白色念珠菌黏附率顯著下降，而且細(xì)胞表面粗糙、皺縮、萎陷、外膜空洞、胞漿內(nèi)容物流出、細(xì)胞壁增厚、質(zhì)壁分離、梁青等[29]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子油具有優(yōu)良的抗白假絲酵母活性，且白假絲酵母在芽痕處對(duì)山蒼子油比較敏感，高濃度的精油(5.0 μL/mL)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆破壞；而且山蒼子油殺菌的靶標(biāo)可能是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，使細(xì)胞內(nèi)大分子外泄，細(xì)胞器變形，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

5 檸檬醛在食品防霉中的應(yīng)用前景

目前，檸檬醛抑制真菌作用的研究取得了一定成果，但其研究主要集中在對(duì)體外真菌的抑制效果和少量抑菌機(jī)理等方面，有關(guān)檸檬醛的應(yīng)用研究，特別是在食品中的防霉研究與應(yīng)用仍然較少，檸檬醛抑菌機(jī)理的研究仍有待加強(qiáng)。展望未來，檸檬醛將在食品領(lǐng)域的防霉研究與應(yīng)用中具有廣闊的發(fā)展前景。

5.1 糧食防霉

糧食在儲(chǔ)藏過程中，受溫濕度、含水量等因素影響，極易產(chǎn)生霉變。真菌是糧食霉變的關(guān)鍵“殺手”，如灰綠曲霉、黃曲霉、青霉等[30]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織估算， 每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)作物產(chǎn)品受霉菌污染，所造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美元。而且霉菌產(chǎn)生的毒素會(huì)使人與動(dòng)物中毒，威脅人類身體健康，尤其黃曲霉毒素危害最為嚴(yán)重[31]，因此，采取措施解決糧食霉變問題至關(guān)重要。而現(xiàn)在防止糧食霉變的解決措施主要有物理方法和添加化學(xué)藥劑法。但物理防霉見效慢、效果差，而化學(xué)藥品例如磷化鋁、芳香烴、有機(jī)酸類等的使用會(huì)帶來很多副作用，如：化學(xué)毒性殘留、環(huán)境二次污染、真菌產(chǎn)生抗藥性，這些給糧食的安全儲(chǔ)藏帶來了潛在威肋[32]。因此，開發(fā)安全、高效、綠色的天然糧食防霉劑取代化學(xué)防霉劑成為必然趨勢(shì)，而檸檬醛作為一種天然抗菌劑，必將在糧食的防霉中發(fā)揮重要作用。

5.2 果蔬防霉

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)階段我國(guó)新鮮果蔬的腐爛損耗率在 30%～50%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家平均損耗率7%的水平[33]。造成果蔬腐爛的主要原因是真菌的感染，影響果蔬的食用價(jià)值、感官價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，甚至對(duì)人體健康及環(huán)境安全產(chǎn)生影響。因此，解決果蔬霉變問題十分重要。長(zhǎng)期以來人們多采用低溫、氣調(diào)、減壓等處理方法配合化學(xué)藥劑或者香料涂膜來防治，而化學(xué)藥劑的使用不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會(huì)增加果蔬農(nóng)藥殘留量，危害人類健康[34,35]。相比之下，植物源防霉劑在人體消化道內(nèi)可降解，不影響消化道菌群和藥用抗菌素的使用[36]，而且安全無毒，具有一定的生理活性。因此，檸檬醛防霉劑的研究與開發(fā)對(duì)促進(jìn)果蔬產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

續(xù) 表

5.3 食用菌防霉

在食用菌栽培過程中，經(jīng)常發(fā)生霉菌污染，霉菌大多數(shù)能夠降解和吸收纖維素，從而影響食用菌的產(chǎn)量，進(jìn)而增加食用菌的生產(chǎn)成本[37]。因此，有效抑制霉菌生長(zhǎng)是食用菌栽培成功的重要因素。所以，為了抑制霉菌污染，在栽培中往往需要在生料拌料時(shí)加入抑菌劑，如多菌靈、克霉靈、代森錳鋅等化學(xué)藥劑，但這些化學(xué)抑菌劑會(huì)造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和增加抗藥性，不利于食用菌的菌絲生長(zhǎng)，影響食用菌的品質(zhì)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，同時(shí)增加成本[38,39]。因此，需要尋找更加安全、高效且成本低的新型抑菌劑來解決這些問題。而檸檬醛類抗菌劑抑菌譜廣、來源足、成本低、綠色、安全，將會(huì)為食用菌栽培過程中的防霉環(huán)節(jié)做出突出貢獻(xiàn)。