黃雪芹，左勇,2*，張強(qiáng)*，楊建飛，徐佳，秦世蓉，何頌捷

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 643000；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101)

宜賓芽菜是中國“四大特色醬菜”之一[1]，歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特，含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分。在腌制過程中，由于微生物的作用，發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，使芽菜香、脆、甜、嫩、美味可口，深受消費(fèi)者喜歡。

芽菜原料是芥菜的嫩莖，新鮮芥菜中亞硝酸鹽主要來源于土壤中固有氮和氮肥，經(jīng)芥菜吸取后以硝酸鹽的形式儲存，在大腸桿菌、副大腸桿菌等有害菌產(chǎn)生的硝酸還原酶作用下，被還原成亞硝酸鹽。亞硝酸鹽具有很強(qiáng)的毒性，一般人體攝入0.3～0.5 g就會引起中毒[2，3]，我國國標(biāo)GB/T 5009.33-2003中規(guī)定醬腌菜中亞硝酸鹽小于20 mg/kg[4]。醬腌菜中亞硝酸鹽的降解，主要方法有物理(合理降低氮肥使用量)、化學(xué)(花色苷、抗壞血酸等對亞硝酸鹽的清除作用)和微生物降解。目前，研究最多的是利用可降解亞硝酸鹽的微生物或其產(chǎn)生的亞硝酸還原酶(NiRs)來降低亞硝酸鹽[5，6]。

芽菜中主要的功能菌是細(xì)菌，包括產(chǎn)酸類細(xì)菌、嗜鹽類、乳酸菌類、芽孢桿菌屬等[7-9]。芽菜在發(fā)酵期間的亞硝酸鹽含量先增加達(dá)到亞硝峰后再降低，發(fā)酵后熟階段含量遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)[10]，這可能與芽菜中富含高效降解亞硝酸鹽菌株有關(guān)，但是關(guān)于這些菌株卻鮮有報(bào)道。本研究采用微生物方法從發(fā)酵芽菜中分離、篩選具有亞硝酸鹽高效降解的菌株，以期豐富醬腌菜中降解亞硝酸鹽的微生物類型，同時(shí)為后期研究制作醬腌菜中亞硝酸鹽發(fā)酵菌劑提供了理論菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

芽菜：取自某芽菜食品有限公司。

主要試劑：DP336細(xì)菌試劑盒、硝酸鉀、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、革蘭氏染色劑。

1.2 培養(yǎng)基[11]

分離培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：相應(yīng)的液體分離培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：含亞硝酸鈉(作為亞硝酸還原酶的誘導(dǎo)物)的液體分離培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 亞硝酸鹽的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

鹽酸萘乙二胺分光光度法[12]。

1.3.2 菌株的分離純化

從芽菜廠取樣并真空保存，樣品取回后在無菌條件下稱取芽菜10 g，加入90 mL無菌生理鹽水(NaCl 0.85%)中，(37±1) ℃，100 r/min恒溫培育過夜后，制備成10-1～10-6的稀釋液，各取0.1 mL均勻涂布于含亞硝酸鹽的3種分離培養(yǎng)基上，每一梯度樣品做3個(gè)平行，(37±1) ℃下于恒溫箱中培養(yǎng)至長出明顯菌落后，挑取單菌落，再用平板劃線法純化，在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基斜面上于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 亞硝酸鹽降解菌初篩

將分離純化得到的菌株制成種子菌懸液，按1%(V/V)接種量接種于濃度為200 μg/mL NaNO2的液體培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行顯色反應(yīng)[13]，觀察顏色變化，以不加菌種的試管為顏色對照(CK)。

由于在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺耦合形成紫紅色染料，故選擇顏色較淺的進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4 亞硝酸鹽降解菌復(fù)篩

將初篩得到的菌株制成種子菌懸液，以接種量為1%(V/V)接種于濃度為400 μg/mL NaNO2的液體培養(yǎng)基(裝液量100 mL/250 mL)中，(37±1) ℃搖床振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間為12，24，36，48，60，72 h時(shí)取樣，于12000 r/min離心1 min除去菌體，取上清液在波長538 nm處檢測亞硝酸鹽剩余量(NE，μg/mL)[14]，計(jì)算剩余亞硝酸鹽含量和降解率。以含200 μg/mL NaNO2未接種的培養(yǎng)基為對照(CK)(NC，μg/mL)。

降解率=(NC-NE)/NC×100%。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌體形態(tài)學(xué)鑒定

菌體、菌落形態(tài)觀察[15]：將菌株接種于培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并記錄菌落的生長情況、顏色和大小、形態(tài)、表面、邊緣、隆起形狀、透明度等。

革蘭氏染色[16]：挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，細(xì)胞保留初染劑(藍(lán)紫色)的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色(紅色)的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。

1.4.2 分子鑒定

細(xì)菌采用16S rDNA分子鑒定[17]：液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)16 h，收集菌液，細(xì)菌總DNA提取按照DP336試劑盒所提供的提取方法進(jìn)行。以提取得到的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板。反應(yīng)體系50 μL，將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后用凝膠成像儀觀察條帶，將觀察到的目的條帶進(jìn)行切膠處理，用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。

細(xì)菌通用引物(27F：GAGAGTTTGATCCTGGCT，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGAC)，以細(xì)菌的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

真菌采用核糖體ITS rDNA區(qū)的通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，以菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。

反應(yīng)體系(50 μL)：DNA 模板為1 μL，PF(10P)1 μL，PR(10P)1 μL，Mix酶25 μL，ddH2O補(bǔ)加至50 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃變性3 min；98 ℃10 s；55 ℃15 s；72 ℃ 20 s，39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，保持4 ℃。

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，送至專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)(擎科生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測序。

1.4.3 DNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的16S rDNA序列在NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上使用BLAST程序在GenBank基因庫上進(jìn)行同源性分析，選擇相似性較高的序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽降解菌初篩

采用3種不同的培養(yǎng)基，挑選5個(gè)不同發(fā)酵階段的芽菜樣品進(jìn)行菌株篩選，共選出53個(gè)能在含亞硝酸鹽培養(yǎng)基上生長的單個(gè)菌落，經(jīng)過初篩的顯色反應(yīng)，篩選出顏色較深的菌株33株，較淺的菌株共20株，部分菌株的顯色結(jié)果見圖1，說明這些菌株都具有降解亞硝酸鹽的能力，只是強(qiáng)弱不同，且部分顏色較淺的菌株具有較強(qiáng)的降解能力。

圖1 顯色反應(yīng)顏色深淺對比圖Fig.1 Color contrast diagrams of chromogenic reaction

2.2 亞硝酸鹽降解菌株復(fù)篩

2.2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為定量檢測亞硝酸鹽的含量，以亞硝酸鹽的濃度為橫坐標(biāo)，以波長538 nm處的吸光度OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制亞硝酸鹽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2 亞硝酸鹽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of nitrite content

由圖2可知，在波長538 nm處，0～0.6 mg/L的濃度范圍內(nèi)，亞硝酸鹽濃度C和吸光度OD值呈良好的線性關(guān)系，滿足方程OD=0.7197C+0.0014，R2=0.9996。

2.2.2 菌株降解亞硝酸鹽結(jié)果

對顯色較淺的20株菌進(jìn)行亞硝酸鹽72 h降解能力的測定，結(jié)果表明，有12株菌的降解率較高，亞硝酸鹽在72 h內(nèi)各菌株的降解情況及降解率結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 培養(yǎng)液中亞硝酸鈉濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢Fig.3 The variation trend of sodium nitrite concentration in culture solution with cultivation time

圖4 分離菌株對亞硝酸鹽降解率的比較Fig.4 The comparison of isolated strains on degradation rates of nitrite

由圖3和圖4可知，篩選得到亞硝酸鹽降解率很高的7株菌株A3、A4、A5、A7、A8、A9、A12，在培養(yǎng)72 h后的降解率均達(dá)到95%以上。其中A5、A7在濃度為400 μg/mL NaNO2的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時(shí)降解率最快，且在培養(yǎng)72 h后降解率接近100%。

2.3 菌落形態(tài)及菌體特征

通過分離、純化、篩選，將從芽菜中篩選出的亞硝酸鹽降解能力較強(qiáng)的7株菌株進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)特征鑒定、革蘭氏染色，結(jié)果見表1。

表1 菌落形態(tài)和革蘭氏染色鑒定表Table 1 The identification results of colony morphology and gram staining

各菌株稀釋10-6倍后，第2天在培養(yǎng)基上開始生長出單菌落，初步判斷菌株能在含亞硝酸鹽培養(yǎng)基上生長。A3、A4的單菌落形態(tài)特征基本相同，白色菌落，表面粗糙，黏著，不規(guī)則；A5、A7菌落形態(tài)不同(見圖5)。A8、A9、A12單菌落形態(tài)特征基本相同，乳白色，表面粗糙，隆起，不規(guī)則。結(jié)合菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果都為陽性，初步判斷7株菌皆為細(xì)菌。

圖5 A5(上)與A7(下)菌株在平板上的培養(yǎng)特征及顯微形態(tài)Fig.5 Culture characteristics and microscopic morphology of strains A5(up) and A7(down) at the plate

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析和分子生物學(xué)點(diǎn)鑒定結(jié)果

2.4.1 亞硝酸鹽還原菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

將降解能力最強(qiáng)的7株菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，經(jīng)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)，電泳結(jié)果見圖6(電泳圖M：DL2000 DNA Ladder)。

圖6 亞硝酸鹽還原菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of nitrite-reducing bacteria 16S rDNA PCR products

由圖6可知，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，各菌株得到的特異性條帶片段大小均在1000～2000 bp之間。

2.4.2 亞硝酸鹽還原菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將7株菌株的PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將16S rDNA測序結(jié)果在NCBI GenBank基因文庫中進(jìn)行比對，選擇相似性不小于99%的序列，使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。

圖7 菌株進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of bacterial strains

經(jīng)過序列的BLAST比對顯示，7株菌株均屬于芽孢桿菌屬的一個(gè)種。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)特征，確定菌株A3、A4同為芽孢桿菌(Bacillussp.)；A5為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；A7為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)；A8、A9、A12同為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

3 結(jié)論

本研究通過菌株降解能力測定，從幾個(gè)不同發(fā)酵階段的芽菜中分離、篩選具有高效降解亞硝酸鹽能力的菌，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示篩選得到的高效降解亞硝酸鹽的菌株皆為芽孢桿菌屬。且培養(yǎng)72 h后7株菌的降解率都接近99%。

芽孢桿菌是一種具有豐富酶系、除氮能力的異養(yǎng)型細(xì)菌，能快速高效地分解外界環(huán)境中的污染物、蛋白質(zhì)及水溶性有機(jī)物。關(guān)于芽孢桿菌降解亞硝酸鹽，報(bào)道最多的是應(yīng)用于水體養(yǎng)殖和水污染治理等方面。但本試驗(yàn)從芽菜中篩選出高效降解亞硝酸鹽的芽孢桿菌屬，說明在醬腌菜的發(fā)酵生產(chǎn)中芽孢桿菌在降解亞硝酸鹽方面具有很大的作用。為后期研究利用菌株產(chǎn)亞硝酸還原酶降解醬腌菜中的亞硝酸鹽提供了可行性菌種。