白彩霞 張達(dá) 趙靚 楊侃侃 王小朋 李新路 李錦春 李永東 王勇

摘要：為建立快速檢測(cè)鵝星狀病毒（GAstV）的方法，本研究根據(jù)GenBank中GAstV ORF2基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-GAstV，以其作為標(biāo)準(zhǔn)品建立了GAstV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。優(yōu)化其反應(yīng)條件及體系，進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)以及臨床樣本檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，除GAstV外，禽白血病病毒（ALV）、血清4型禽腺病毒（FAdV-4）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）和雞傳染性貧血病病毒（CIAV）等常見(jiàn)禽病病原利用該方法檢測(cè)均呈陰性，表明其特異性良好;建立的熒光定量RT-PCR檢出的最低模板含量為1 μl 3.75×101拷貝，敏感性較高;組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于1 %。利用該方法對(duì)來(lái)自安徽地區(qū)的32份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為43.75%，常規(guī)PCR方法陽(yáng)性檢出率為18.75%，陽(yáng)性檢出符合率100%，表明該方法可用于臨床樣品檢測(cè)。該方法的建立為臨床樣品中GAstV的快速高效檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：鵝星狀病毒;SYBR Green I 熒光定量RT-PCR;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0634-05

Development and application of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of goose astrovirus

BAI Cai-xia1，ZHANG Da1，ZHAO Liang1，YANG Kan-kan1，WANG Xiao-peng1，LI Xin-lu1，LI Jin-chun1，LI Yong-dong2，WANG Yong1

（1.College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China;2.Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention， Ningbo 315010， China）

Abstract：In order to rapidly detect the goose astrovirus （GAstV）， the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established. Firstly， a pair of specific primers was designed based on the ORF2 gene sequence of the GAstV in GenBank. Secondly， the recombinant plasmid pMD19-T-GAstV was constructed and used as a standard template to generate the standard curve. The reaction conditions and reaction system were optimized， the specificity， sensitivity and reproducibility of the assay were tested. Moreover， the established assay was used in clinical samples detection. The results showed that the detection results of fowl adenovirus serotype 4（FAdV-4）， infectious laryngotracheitis virus（ILTV）， avian leukosis virus（ALV）， chicken infectious anemia virus（CIAV） and other common avian pathogens were negative except the GAstV. It indicated that the assay had good specificity. The lowest template content detected by fluorescence quantitative RT-PCR assay was 3.75×101 copies per milliliter. The variation coefficients in the repeatability test were less than 1%. Thirty-two clinical samples from Anhui province were tested using this assay. The positive detection rate was 43.75%， the positive rate of conventional PCR was 18.75%， and the coincidence rate was 100%. In conclusion， the established assay provides technical support for the rapid and efficient detection of GAstV in clinical samples.

Key words：goose astrovirus（GAstV）;SYBR Green I flucrescence quantitative RT-PCR;detection

星狀病毒（Astroviruses，AstV）屬于星狀病毒科，為無(wú)囊膜、單股正鏈RNA病毒[1]?；蚪M全長(zhǎng)6.9～7.9 kb，包括5′UTR，3個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1a、ORF1b、ORF2，3′UTR及多聚腺苷酸（polyA）尾[2]?？筛鶕?jù)感染宿主的不同分為哺乳動(dòng)物星狀病毒和禽類星狀病毒。哺乳動(dòng)物星狀病毒包括人類、貓、豬、羊和水貂星狀病毒;禽類星狀病毒包括雞、鴨、火雞星狀病毒及禽腎炎病毒[3-5]。2017年中國(guó)多個(gè)省份的鵝養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)一種以內(nèi)臟和關(guān)節(jié)出現(xiàn)尿酸鹽沉積為主要臨床特征的新發(fā)疾病，該病造成雛鵝的大量死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要發(fā)生在5～20日齡的雛鵝，死亡率最高可達(dá)50%[6-7]?；疾‰r鵝精神沉郁，采食量減少，關(guān)節(jié)腫大;尸檢可見(jiàn)內(nèi)臟器官大量尿酸鹽沉積，尤其是肝臟、心臟及腎臟[8]。Niu等首次從病鵝組織中分離出一種新型的鵝源星狀病毒（Goose astrovirus，GAstV）[6-7]。

目前尚無(wú)針對(duì)該病的治療措施及疫苗，防治重點(diǎn)在于疫情的檢測(cè)和控制。因此建立一種快速、準(zhǔn)確和省時(shí)的檢測(cè)方法對(duì)疫情的防控尤為重要。然而目前檢測(cè)GAstV常用方法是PCR，與熒光定量RT-PCR相比該方法具有交叉污染且耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，不適用于大量臨床樣品的檢測(cè)[9-10]。而SYBR Green I熒光定量PCR作為一種通用的病原體檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，能在較短時(shí)間內(nèi)完成病原體檢測(cè)，已被廣泛用于動(dòng)物疾病的臨床診斷。因此，本研究旨在建立一種基于SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的快速檢測(cè)GAstV的方法，為GAstV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1病毒及臨床樣品

禽白血病病毒（ALV）、血清4型禽腺病毒（FAdV-4）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞傳染性貧血病病毒（CIAV）均由本實(shí)驗(yàn)室保存;GAstV感染的鵝心、肝和腎等樣品采用文獻(xiàn)[6]的方法檢測(cè)為GAstV陽(yáng)性后由本實(shí)驗(yàn)室保存;疑似GAstV感染的32份心、肝和腎臨床樣品于2018年采自安徽省不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2主要試劑

pMD19-T載體、DL600 DNA marker、rTaq DNA聚合酶、Solution I和TB GreenTM Premix DimerEraserTM （Perfect Real Time） 購(gòu)自 TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和FastQuant RT Kit（with gDNase）購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的GAstV病毒株（MH052598.1）ORF2閱讀框堿基序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（F：5′-CGATGAGAAGGAGCAACACA-3′，R：5′-CAGAATTTGAAGCAGCACCA-3′），預(yù)期擴(kuò)增片段為182 bp。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.4DNA/RNA的提取及cDNA的合成

取適量鑒定為GAstV陽(yáng)性的心、肝和腎等組織加入含青霉素和鏈霉素各1 000 IU/ml的PBS用研缽充分碾磨，置于-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱待用。利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取FAdV-4、ILTV病毒基因組DNA，ALV、CIAV、GAstV病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后與上述病毒DNA分別置于-20 ℃保存。

1.5重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以提取的鑒定為GAstV陽(yáng)性的cDNA為模板，采用引物F/R進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化擴(kuò)增產(chǎn)物，將其克隆于pMD19-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-GAstV，由南京擎科生物科技有限公司測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值，按照拷貝數(shù)計(jì)算公式（質(zhì)粒濃度×6.02×1023）/（109×基因組長(zhǎng)度×660），計(jì)算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.6熒光定量RT-PCR方法的建立與優(yōu)化

采用TB GreenTM Premix DimerEraserTM （Perfect Real Time） 試劑盒推薦的25 μl反應(yīng)體系，以出現(xiàn)最小Ct值和最高熒光值以及不出現(xiàn)非特異擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)，采用方陣法分別對(duì)引物濃度（0.2～1.0 μmol/L）、退火溫度（50～60 ℃）、延伸時(shí)間（20～32 s）等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件及體系。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的建立

以10倍倍比稀釋為8個(gè)梯度（1 μl 3.75×101～3.75×108拷貝）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（ddH2O）。用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照做3個(gè)重復(fù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。待反應(yīng)結(jié)束后，建立熔解曲線。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：Ct值≤30并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線和較為一致的熔解曲線，即判定結(jié)果為“陽(yáng)性”;被檢樣品3035判定為“陰性”。

1.8特異性試驗(yàn)

以提取的FAdV-4、ILTV、ALV、CIAV的DNA/cDNA為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（ddH2O）及陽(yáng)性對(duì)照（GAstV），驗(yàn)證該方法的特異性。

1.9敏感性試驗(yàn)

用8個(gè)稀釋梯度（1 μl 3.75×101～3.75×108拷貝）的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)該方法可檢出的最低模板拷貝數(shù)。同時(shí)用常規(guī)PCR方法對(duì)相同稀釋梯度的模板進(jìn)行擴(kuò)增，將2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR方法敏感性。

1.10重復(fù)性試驗(yàn)

用3個(gè)稀釋梯度（1 μl 3.75×108、1 μl 3.75×105、1 μl 3.75×102）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在同一時(shí)間或者不同時(shí)間段檢測(cè)3次，進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.11臨床樣品的檢測(cè)

根據(jù)基因組提取試劑盒使用說(shuō)明書提取32份臨床樣品基因組，采用本研究建立的熒光定量RT-PCR及常規(guī)PCR方法對(duì)32份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算2種檢測(cè)方法的符合率。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

利用F/R引物，對(duì)GAstV陽(yáng)性病料的基因組cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約182 bp的單一特異性片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將該目的基因片段克隆至pMD19-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的片段序列一致，表明pMD19-T-GAstV重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

M：DL600 DNA marker;1：陰性對(duì)照;2：GAstV RT-PCR產(chǎn)物。

2.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化后確定最佳反應(yīng)體系為（25.00 μl）：TB Green Premix DimerEraser（2×）12.50 μl，上游引物、下游引物（10 mmol/L）各0.75 μl，模板2.00 μl，加入ddH2O補(bǔ)足至25.00 μl。最佳反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：65 ℃以0.5 ℃/s升至95 ℃。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線分析結(jié)果

用建立的熒光定量RT-PCR對(duì)1 μl 3.75×101拷貝至3.75×108拷貝梯度的GAstV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒含量呈良好線性關(guān)系（圖2A）。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.065x+33.738，擴(kuò)增效率（E）=105%，相關(guān)系數(shù)（r）=0.993。熔解曲線顯示，熔解溫度（Tm）在84.5 ℃時(shí)出現(xiàn)特異性單峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物（圖2B）。

2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用本研究建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)幾種臨床常見(jiàn)禽病病原進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅GAstV出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他病原及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增曲線（圖3）。表明該方法特異性良好。

2.5敏感性試驗(yàn)結(jié)果

敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，常規(guī)PCR可檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低含量為1 μl 3.75×103 拷貝 （圖4A），而熒光定量RT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低含量為1 μl 3.75×101拷貝（圖4B），熒光定量RT-PCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍。表明本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR敏感性較高。

A：熒光定量RT-PCR;B：常規(guī) PCR。1～8： 1 μl 3.75×108 ～3.75×101拷貝;9：陰性對(duì)照。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

利用本研究建立的方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該方法的組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1.0%（表1）。表明本研究建立的熒光定量RT-PCR方法有較好的重復(fù)性。

2.7臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

在32份疑似GAstV感染病料中，熒光定量RT-PCR檢出陽(yáng)性樣品14份，陽(yáng)性率為43.75%，常規(guī)PCR檢出陽(yáng)性樣品6份，陽(yáng)性率為18.75%，兩者符合率為100%。表明本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法敏感性更高，可適用于臨床檢測(cè)。

3討論

截至目前，中國(guó)山東、江蘇、安徽、河南、遼寧和廣東等地區(qū)鵝養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)出現(xiàn)一種以雛鵝痛風(fēng)為主要癥狀的急性傳染病。先前有研究者指出該病的發(fā)生可能是由于超量高蛋白高鈣飼料的使用導(dǎo)致[11-12]，但實(shí)踐證明，更換低蛋白飼料后，疫情并未得到改善。直至GAstV被成功分離鑒定[7]，才確定真正病因。迄今為止對(duì)GAstV致病性及病理機(jī)制尚不清楚，因此，建立特異敏感的檢測(cè)技術(shù)，可為后期GAstV的感染機(jī)制和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)病毒性傳染病已廣泛應(yīng)用于臨床診斷[13-15]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的檢測(cè)技術(shù)，在動(dòng)物疾病的檢疫、基因表達(dá)分析等各種領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[16]。與常規(guī)PCR相比，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)[17]。除此之外，還能夠顯著減少試驗(yàn)過(guò)程中的污染及對(duì)人體有致癌危害的EB的使用。該檢測(cè)技術(shù)包括SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè)?。TaqMan探針需要合成標(biāo)記有熒光素的探針，成本較高。而SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA的熒光染料，在熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合釋放熒光信號(hào)，通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單和可定量分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為病毒檢測(cè)的重要方法。Yuan等[9]建立了TaqMan探針?lè)z測(cè)GAstV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，需合成針對(duì)性很強(qiáng)的核酸探針，成本較高。本研究建立的方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，不需要設(shè)計(jì)探針，更加簡(jiǎn)便，通過(guò)熔解曲線分析即可區(qū)分非特異性擴(kuò)增，而且SYBR Green I染料成本低，可通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算定量結(jié)果，不需要普通PCR后的電泳檢測(cè)，操作更加簡(jiǎn)單、省時(shí)。

本研究根據(jù)GAstV ORF2基因保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)已鑒定為GAstV陽(yáng)性的病料進(jìn)行普通PCR檢測(cè)、序列測(cè)定及分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的片段條帶單一且與預(yù)期片段大小相符，熔解曲線呈現(xiàn)特異性良好的單峰，確定所用引物具有良好的特異性，保證了后續(xù)建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。在該引物的基礎(chǔ)上建立基于SYBR Green I染料法的GAstV 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。有資料報(bào)道，擴(kuò)增效率小于105%、決定系數(shù)大于0.98、△Ct值變異系數(shù)小于10%是評(píng)估一種熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的主要參數(shù)[18]，精確靈敏度的確定需要滿足這3個(gè)前提條件。本研究建立的方法擴(kuò)增效率為105%，相關(guān)系數(shù)為0.993，精確靈敏度為1 μl 3.75×101拷貝，表明具有良好的線性關(guān)系;與禽類常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng)，表明特異性較好;組內(nèi)和組間變異系數(shù)小于1%，表明具有良好的重復(fù)性。

綜上所述，本研究建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，自動(dòng)分析結(jié)果，避免了空氣中的交叉污染，可在短時(shí)間內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果。該方法的建立為GAstV流行病學(xué)調(diào)查以及臨床診斷提供了有效的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)：

[1]YUAN X Y， MENG K， ZHANG Y X， et al. Genome analysis of newly emerging goose-origin nephrotic astrovirus in China reveals it belongs to a novel genetically distinct astrovirus[J]. Infect Genet Evol， 2019， 67：1-6.

[2]PANTINJACKWOOD M J， STROTHER K O， MUNDT E， et al. Molecular characterization of avian astroviruses[J]. Arch Virol， 2011， 156（2）：235-244.

[3]SUN N， YANG Y， WANG G S， et al. Detection and characterization of avastrovirus associated with diarrhea isolated from minks in China[J]. Food Environ Virol， 2014， 6（3）： 169-174.

[4]MARINA B， DARKO M， ZDENKO B， et al. Genetic characterization of turkey astroviruses identified in Croatian poultry flocks[J]. Vet Archiv， 2013，83（1）：57-67.

[5]MARY J P， ERICA S， PETER R W. Molecular characterization and typing of chicken and turkey astroviruses circulating in the United States： Implications for diagnostics.[J]. Avian Dis， 2006， 50（3）：397-404.

[6]NIU X Y， TIAN J J， YANG J， et al. Novel goose astrovirus associated gout in gosling， China.[J]. Vet Microbiol， 2018， 220：53-56.

[7]ZHANG Q S， CAO Y X， WANG J， et al. Isolation and characterization of an astrovirus causing fatal visceral gout in domestic goslings[J]. Emerg Microbes Infect， 2018， 7（1）：71.

[8]ZHANG X Y， REN D， LI T F， et al. An emerging novel goose astrovirus associated with gosling gout disease， China[J]. Emerg Microbes Infect， 2018， 7（1）：152.

[9]YUAN X Y， MENG K， ZHANG Y X， et al. Establishment and application of rapid diagnosis for reverse transcription-quantitative PCR of newly emerging goose-origin nephrotic astrovirus in China[J]. mSphere， 2018， 3（6）：e00380.

[10]IAN M M， KATHERINE E A， ANDREAS N. Real-time PCR in virology[J]. Nucleic Acids Res， 2002， 30（6）： 1292-1305.

[11]周紅英. 一例雛鵝痛風(fēng)病的診治[J]. 畜禽業(yè)， 2017（7）：120-121.

[12]陳英輝. 鵝痛風(fēng)的發(fā)生原因與診治[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息， 2017（4）：112.

[13]楊慧贊，童桂香，鄭曉聰，等. IHHNV PCR檢測(cè)方法改進(jìn)及廣西流行株基因型分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（5）：1127-1132.

[14]楚會(huì)萌，任亞初，程凱慧，等. 一株牛流行熱病毒的分離與鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，51（3）：111-114.

[15]彭昊，吳翠蘭，李軍，等. 廣西黃牛乳頭狀瘤病毒的鑒定及其基因組序列分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（3）： 563-571.

[16]周曉俊，朱淮民，邱璐. 檢測(cè)蚊蟲感染黃病毒屬病毒Real-time PCR方法的建立[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志， 2008， 3（8）：561-563.

[17]CHANDRA B P， RISHI S， VIJAI K G， et al. Q-PCR based culture-independent enumeration and detection of enterobacter： an emerging environmental human pathogen in riverine systems and potable water[J]. Front Microbiol， 2016， 7：172.

[18]DAVID N， MARIO A， LLOREN G R， et al. Dynamics of Torque teno sus virus 1 （TTSuV1） and 2 （TTSuV2） DNA loads in serum of healthy and postweaning multisystemic wasting syndrome （PMWS） affected pigs[J]. Vet Microbiol， 2011， 152（3/4）：284-290.

（責(zé)任編輯：陳海霞）