朱旭飛 田鵬飛 童甜甜 雷祎凡 何林瑾

摘 要：由于甘草品種混雜且發(fā)芽率較低，使得野生甘草種子難以滿足生產(chǎn)需求，故需要基于合適的外植體借助組織培養(yǎng)技術(shù)進行快速繁殖。對此，筆者通過構(gòu)建甘草組織快繁體系展開研究，以期有助于解決甘草生產(chǎn)難題，促進甘草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

關(guān)鍵詞：甘草組織快繁;外植體;誘導(dǎo)

甘草這一常用藥材有著巨大的市場需求，但野生資源供不應(yīng)求，只能選擇人工種植。所以為消除甘草生產(chǎn)瓶頸，提高甘草品質(zhì)，分別從外植體誘導(dǎo)生成叢狀莖和愈傷組織誘導(dǎo)分化兩大途徑對甘草組織快繁做了研究，并對兩者做了比較分析，以期尋求最佳的快繁方式。

一、構(gòu)建甘草組織快繁體系

（一）基于甘草優(yōu)良株系建立無菌培養(yǎng)體系

首先，經(jīng)比較實驗，選取了3.2%甘草酸含量的優(yōu)質(zhì)甘草株系JA-1為實驗材料，按照相關(guān)要求配制了4份不同成分的MS培養(yǎng)基。其次，在種子萌發(fā)實驗中，預(yù)先將甘草種子置于H2SO4中浸泡1.5min，隨后設(shè)定不同的滅菌時間、激素處理、培養(yǎng)溫度等條件，分析7d后種子的萌發(fā)率。再者，根據(jù)實驗結(jié)果得到，滅菌時間會嚴重影響甘草種子的萌發(fā)率，最佳時間為8min;激素的種類與濃度對種子萌發(fā)的促進作用有所不同;培養(yǎng)溫度則應(yīng)控制在25～30℃之間。最后是實驗結(jié)論，即經(jīng)硫酸軟化后的甘草種子應(yīng)依次經(jīng)HgCl2（0.1%）滅菌8min和酒精（70%）浸泡60s，隨后接入含有激素1.0mg/L6-BA與0.2mg/LIBA的MS培養(yǎng)基中，置于25～30℃環(huán)境下萌發(fā)，最終獲得80%的萌發(fā)率。

（二）甘草組織快繁實驗方法

選取前文培養(yǎng)得到的無菌苗為本次實驗材料，準備精密電子天平、磁力攪拌器、移液器、自動滅菌鍋、微波爐、蒸餾器等設(shè)備，以及NH4NO3、KNO3、Na2EDTA、煙酸、乙醇、肌醇、瓊脂、VBI、VB6等試劑，開展甘草組織快繁實驗。

1.外植體誘導(dǎo)生成從狀莖。本次實驗采用的是4因素4水平的正交法，即外植體的莖尖、腋芽、新梢以及帶芽莖段，濃度（mg/L）為0.5、1、1.5、2的6-BA，濃度（mg/L）為0.05、0.1、0.25、0.5的IBA，濃度（g/L）為10、20、30、40的蔗糖。隨后接入MS培養(yǎng)基（0.8%瓊脂，pH值5.8）重復(fù)三次操作，每個處理的4個瓶子中均帶有5個外植體，并在2000lx照度下和25℃的溫度下進行培養(yǎng)，4周后對不定芽增值倍數(shù)以及高于1cm的新梢率加以統(tǒng)計。

2.愈傷組織的誘導(dǎo)與分化。該實驗分兩步進行，一是在誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程中也采用了正交法，即以外植體類型、6-BA濃度、蔗糖濃度和2，4-D濃度為4個因素，以外植體中下胚軸、子葉、胚根以及芽，濃度（mg/L）為0.2、0.5、1.0、1.5的6-BA，濃度（g/L）為10、20、30、40的蔗糖，濃度（mg/L）為0.5、1.0、1.5、2.0的2，4-D為4個水平進行實驗。接種時切取長0.5cm的胚根和胚軸小段，在芽和子葉表面劃幾個切口，分別接入實驗組的培養(yǎng)基（0.8%瓊脂，pH值5.8），每組接入5瓶（均帶有4塊材料），重復(fù)以上實驗3次，先在25℃下暗培養(yǎng)3～4d，后以2000lx的照度光照12h/d，2周后對愈傷組織的顏色、形態(tài)、每塊材料凈增鮮重平均值和誘導(dǎo)率進行統(tǒng)計。二是選取下胚軸愈傷組織作分化實驗，此時采用3因素3水平正交實驗，即濃度（mg/L）為0、0.5、1.0的6-BA，濃度（mg/L）為0.05、0.1、0.15的NAA，濃度（mg/L）為0、0.5、1.0的TDZ。切取1cm3的塊狀愈傷組織置于超凈工作臺進行培養(yǎng)基接種，每組接種10瓶，每瓶5塊材料，置于照度2000lx和25℃下培養(yǎng)，光照時間設(shè)為12h/d，于4周后對其分化率進行統(tǒng)計。子葉、胚根以及芽的分化實驗同上。

3.生根實驗。基于上述兩組組織快繁所得的試管苗開始生根實驗，即切取無菌苗為長3～5cm且至少帶有1個腋芽的莖段，置于無菌操作臺用于成分配比不同的生根培養(yǎng)基（0.8%瓊脂、pH值5.8、3%蔗糖）的接入，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶帶有莖段5個，在照度2000lx和25℃下培養(yǎng)20d，其中光照時間設(shè)為12h/d，重復(fù)3次對其生根率進行觀察和統(tǒng)計。

4.煉苗移栽。分別選取生根培養(yǎng)2、3、4、5周的試管苗，保持其他條件不變只打開培養(yǎng)瓶的封口膜，置于弱光環(huán)境下3d用于煉苗，為免染菌，清洗根部位置的培養(yǎng)基后再用多菌靈（1000倍）浸泡殺菌2h后移至草炭灰：珍珠巖：蛭石為1：1：1的培養(yǎng)基中，澆水后覆蓋塑料薄膜，2周后扎透氣小孔。每組移栽50株并要求重復(fù)3次，對其成活率加以分別統(tǒng)計。

二、實驗結(jié)果的分析與討論

（一）數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表明，蔗糖、6-BA、IBA、外植體對叢生芽誘導(dǎo)增值倍數(shù)的影響依次增大，其中2000lx照度和25℃條件下，MS+1mg/L6-BA+0.25mg/LIBA+30g/L蔗糖培養(yǎng)基中有效新梢率最高，達到了78.6%。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體是下胚軸，最適宜的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA，此時誘導(dǎo)率與凈增鮮重分別為100%和3.4g;同時下胚軸還最易誘導(dǎo)愈傷組織分化，其次為芽。對比生根結(jié)果可知，外植體誘導(dǎo)叢生芽與愈傷組織誘導(dǎo)分化相差不大，但前者略高于后者，并在培養(yǎng)試管苗4周后具有最高的移栽成活率。

（二）結(jié)論

通過綜合比較與分析，判斷外植體誘導(dǎo)叢生芽更適合用于甘草組織快繁，而且經(jīng)后續(xù)形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)以及SPAP的觀察與檢測，試管苗并未出現(xiàn)遺傳變異，說明該實驗下的試管苗遺傳穩(wěn)定性良好。

三、結(jié)束語

總之，基于上述實驗方法與操作，發(fā)現(xiàn)在照度、溫度、光照時間一定的情況下，甘草組織快繁會受到外植體類型和激素類型與濃度等的影響，且外植體誘導(dǎo)叢生芽途徑不僅在甘草組織快繁中更具優(yōu)勢，而且穩(wěn)定性良好，值得深入研究。

參考文獻：

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[2]汪連海.甘草快速繁殖技術(shù)及影響因素的研究[D].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

基金項目：延安大學(xué)2018年校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“陜北“三大寶”-甘草的組織快繁研究”，編號：D2018089。