胡 麗,彭文婷,盧浩成,王 軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,葡萄與葡萄酒研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

決定釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)的因素很多,主要包括糖、酸、單寧、酚類以及香氣物質(zhì)的含量和組成等[1-2]。酚類物質(zhì)主要存在于葡萄種子和葡萄果皮中,是一類非常重要的次生代謝產(chǎn)物,可賦予葡萄果實(shí)和葡萄酒以不同的風(fēng)味。酚類物質(zhì)不僅可以幫助植物抵御強(qiáng)烈紫外線照射、抵抗一些病原菌和害蟲的傷害,還因其含有的羥基和不飽和雙鍵易被氧化而具有良好的抗氧化性[3]。根據(jù)代謝路徑的不同,葡萄果實(shí)的酚類物質(zhì)可分為主要在果肉中積累的非類黃酮化合物和主要在外果皮、種子和莖中積累的類黃酮化合物。類黃酮化合物是自然界中分布較廣的酚類物質(zhì),主要包括花色苷、黃酮醇和黃烷-3-醇等。

花色苷是由具有C6—C3—C6骨架的類黃酮花色素和糖配體組成[4],是糖基化的花色素,葡萄糖與花色素通過糖苷鍵結(jié)合可以形成穩(wěn)定的花色苷,而葡萄糖又可以進(jìn)一步通過酯化、乙?；⑾愣辊；蛘呖Х弱；蝗〈?如此形成的各類花色苷在不同的pH值條件下會(huì)呈現(xiàn)不同的色調(diào),這對(duì)葡萄酒的顏色起著至關(guān)重要的作用[5]。黃酮醇是一種多以糖苷形式存在于葡萄果實(shí)中的類黃酮物質(zhì),且主要存在于果皮中,具有防護(hù)紫外線損傷、輔色素化、清除自由基和促進(jìn)花粉管伸長(zhǎng)等生理功能[6];在紅葡萄酒中,黃酮醇中的輔色素分子如楊梅苷和槲皮素等可以與單體花色苷相互作用生成穩(wěn)定的復(fù)合物使紅葡萄酒顏色更加穩(wěn)定[7]。黃烷-3-醇是葡萄果實(shí)中含量最多的類黃酮化合物,主要存在于葡萄的皮和種子中。黃烷-3-醇類物質(zhì)不僅賦予葡萄酒以苦味和澀味,還對(duì)葡萄酒的陳釀潛力有一定影響。

葡萄和葡萄酒中的香氣物質(zhì)種類豐富,主要包括醇類、酯類、醛類、酸類、萜烯類、降異戊二烯類和甲氧基吡嗪類,這些化合物的含量差異很大,有的質(zhì)量濃度能達(dá)到mg/L級(jí),有的僅痕量ng/L級(jí),有的甚至檢測(cè)不到[8]。根據(jù)存在形式可將這些化合物分為游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)2 種形式,游離態(tài)香氣物質(zhì)具有揮發(fā)性,而糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)本身不具有揮發(fā)性,但可在酶解或酸解的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袚]發(fā)性的、游離態(tài)的香氣物質(zhì),因而糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)是一種重要的、潛在的香氣成分[9]。揮發(fā)性香氣物質(zhì)是葡萄中重要的風(fēng)味物質(zhì),這些物質(zhì)的種類、含量、感官閾值及其之間的相互作用不僅決定葡萄果實(shí)的風(fēng)味,還決定葡萄酒的風(fēng)味和典型性[2]。

葡萄果實(shí)的酚類物質(zhì)含量以及揮發(fā)性香氣成分因種群、品種、產(chǎn)地、栽培等不同而具有較大差異,邢婷婷等[10]對(duì)14 個(gè)歐亞種紅色釀酒葡萄品種(品系)的花色苷組成和含量進(jìn)行了分析,得出不同品種單體花色苷所占比例有明顯差異,花色苷可作為化學(xué)指紋區(qū)分這14 個(gè)葡萄品種(品系);張娟等[11]對(duì)采自黃土高原產(chǎn)區(qū)的20 種釀酒紅葡萄品種中的酚類物質(zhì)進(jìn)行了差異分析,表明根據(jù)不同葡萄酚類物質(zhì)的特性,可有選擇性的進(jìn)行葡萄選育工作;涂正順等[12]對(duì)吉林地區(qū)的山葡萄果實(shí)香氣成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析,結(jié)果表明‘雙優(yōu)’、‘雙紅’、‘左優(yōu)紅’果實(shí)中分別含有45、47、48 種香氣物質(zhì)。類似上述的研究在國(guó)內(nèi)有較多報(bào)道[13-15],但其中有關(guān)歐亞種葡萄和山葡萄果實(shí)類黃酮及香氣物質(zhì)含量和組成的差異比較研究較少。因此,本研究以7 個(gè)遺傳背景不同的成熟葡萄果實(shí)為材料,供試材料分別為歐亞種葡萄‘赤霞珠’(無(wú)性系338和685)和‘寶石解百納’,山葡萄品種‘雙紅’、‘雙優(yōu)’和‘雙豐’,以及山歐雜種葡萄品種‘北冰紅’,利用高效液相色譜-質(zhì)譜(high performance liquid chromatographymass spectrometry,HPLC-MS)聯(lián)用和GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)葡萄果實(shí)中的類黃酮和香氣物質(zhì),比較釀酒葡萄不同品種(品系)果實(shí)類黃酮及香氣物質(zhì)含量和組成的差異,為后續(xù)的品種鑒定和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)于2018年在北京市海淀區(qū)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站(40°08′12.15″N,116°10′44.83″E)進(jìn)行,供試葡萄品種(品系)信息如表1所示。南北行向,栽植密度為2.5 m×1.2 m,葉幕形為改良的垂直葉幕形[16],葉幕高度120 cm左右,寬度70 cm左右,留梢量為12～15 支每延長(zhǎng)米(行),葡萄園灌溉方式為滴灌,葡萄園管理采用常規(guī)管理。

葡萄果實(shí)于成熟期(2018/8/21—9/26)采集。采樣時(shí)選擇葉幕兩側(cè),果穗的曝光和背光兩面,隨機(jī)采集果穗底部、中部和頂部無(wú)物理性損傷、發(fā)育健康的果實(shí),每次重復(fù)采集約300 粒漿果,重復(fù)3 次。采集樣品裝入冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,取50～100 粒漿果進(jìn)行理化指標(biāo)分析,其余漿果用液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中,用于類黃酮物質(zhì)及香氣化合物的測(cè)定與分析。

表1 供試葡萄品種（品系）信息Table 1 Information about different grape varieties (clones)investigated in this study

1.1.2 試劑

乙酸鈉、甲醇、二氯甲烷、丙酮(均為分析純)北京化工廠;類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品:二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、兒茶素(catechin,C)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表?xiàng)攦翰杷?epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷 美國(guó)Sigma公司;乙腈、甲酸、甲醇(均為色譜純) 美國(guó)Fisher公司;AR2000糖苷酶 法國(guó)DSM公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Micro 17R離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司;1100系列LC/MSD Trap-VL HPLC-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有二極管陣列檢測(cè)器)、1200系列LC/MSD Trap-VL HPLC-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、1200系列HPLC串聯(lián)Bruker系列離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)、6890-5975GCMS儀 美國(guó)Agilent公司;Cleanert PEP-SPE固相萃取柱(150 mg/6 mL) 美國(guó)Bonna-Agela科技公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果皮花色苷的提取和測(cè)定

參照Downey等[17]的方法。準(zhǔn)確稱取0.100 g葡萄果皮凍干粉于2 mL離心管中,加入50%甲醇溶液1 mL,低溫避光超聲萃取20 min后,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,隨后轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管中,殘?jiān)貜?fù)上述步驟,合并2 次提取的上清液,充分混勻后,用0.22 μm有機(jī)膜過濾,用于HPLC-MS檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次。花色苷的定性根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒研究中心建立的葡萄與葡萄酒花色苷指紋譜庫(kù)[18],花色苷定量用外標(biāo)法,以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)出各類花色苷類物質(zhì)均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線:y＝59.221x+16.112 8,相關(guān)系數(shù)為0.998 9。果皮中的花色苷含量以果實(shí)鮮質(zhì)量表示,單位為mg/kg。

HPLC-MS條件:花色苷定性和定量分析使用1100系列HPLC-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱為Kromasil100-5-C18(250 mm×4.6 mm),柱溫50 ℃,進(jìn)樣量30 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm,流速1 mL/min。流動(dòng)相A:水-甲酸-乙腈(92∶2∶6,V/V);流動(dòng)相B:水-甲酸-乙腈(44∶2∶54,V/V)。洗脫程序:0～1 min,100%～90% A,0%～10% B;1～18 min,90%～75% A,10%～25% B;18～20 min,75% A,25% B;20～30 min,75%～60% A,25%～40% B;30～35 min,60%～30% A,4 0%～7 0% B;3 5～4 0 m i n,3 0%～0% A,7 0%～1 0 0% B。離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器的采集參數(shù)為電噴霧離子源,正離子模式,離子掃描范圍為100～1 500 m/z,霧化器壓力為30 psi,干燥器流速為10 L/min,干燥氣溫度為325 ℃。

1.3.2 葡萄果皮黃酮醇的提取和測(cè)定

參照1.3.1節(jié)花色苷的提取方法,提取后的上清液用0.22 μm有機(jī)膜過濾,用于HPLC-MS檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次。黃酮醇物質(zhì)定性方法參照參考文獻(xiàn)[19],黃酮醇定量用外標(biāo)法,以槲皮素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)出的黃酮醇類物質(zhì)均以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線:y＝59.029x-42.801,相關(guān)系數(shù)為0.997。果皮中的黃酮醇含量以果實(shí)鮮質(zhì)量表示,單位為mg/kg。

HPLC-MS條件:黃酮醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串聯(lián)Bruker系列的離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm)。柱溫40℃,進(jìn)樣量50 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm,流速0.63 mL/min。流動(dòng)相A:水-甲酸-乙腈(86.5∶8.5∶5,V/V);流動(dòng)相B:甲酸-水-乙腈-甲醇(8.5∶21.5∶25∶45,V/V)。洗脫程序:0～24.2 min,100%～85.8% A,0%～14.2% B;24.2～27 min,85.8%～84.3% A,14.2%～15.7% B;27～33.4 min,84.3%～81.2% A,15.7%～18.8% B;33.4～39 min,81.2%～76.5% A,18.8%～23.5% B;39～45 min,76.5%～74% A,23.5%～26% B;45～47 min,74%～72.6% A,26%～27.4% B;47～51.6 min,72.6%～68% A,27.4%～32% B;51.6～61.8 min,68%～60% A,32%～40% B;61.8～67.8 min,60%～0% A,40%～100% B;67.8～78.4 min,0%～100% A,100%～0% B。離子阱質(zhì)譜采用電噴霧離子源,負(fù)離子模式,離子掃描范圍為m/z 0～1 000,霧化氣壓力為30 psi,干燥氣流速為10 L/min,干燥氣溫度為325 ℃。

1.3.3 葡萄果皮和種子黃烷-3-醇的提取和測(cè)定[20]

游離黃烷-3-醇提取:準(zhǔn)確稱取0.050 g葡萄果皮/種子凍干粉于2 mL的離心管中,加入含0.5%抗壞血酸的70%丙酮溶液500 μL,充分振蕩5 min后,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的5 mL離心管中,重復(fù)上述操作3 次,將3 次所得上清液合并后搖勻。再取400 μL上述提取液于2 mL離心管中,在常溫避光條件下進(jìn)行氮吹。吹干后加入200 μL含1% HCl的甲醇溶液溶解,再加入200 μL的200 mmol/L乙酸鈉溶液中和,將溶解后的溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾,用于HPLC-MS檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次。

裂解黃烷-3-醇提取:準(zhǔn)確稱取0.100 g果皮/種子凍干粉于2 mL的離心管中,加入間苯三酚緩沖液(0.5%抗壞血酸,0.3 mol/L鹽酸,50 g/L間苯三酚甲醇溶液)1 mL,在50 ℃避光水浴20 min后,加入0.2 mol/L的乙酸鈉溶液1 mL終止反應(yīng)。4 ℃、8 000 r/min離心15 min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,重復(fù)上述操作3 次,將3 次所得上清液合并后搖勻,經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾,用于HPLC-MS檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次。

黃烷-3-醇的定性根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒研究中心建立的葡萄與葡萄酒黃烷-3-醇指紋譜庫(kù)[20]。黃烷-3-醇的聚合體在酸性條件下發(fā)生裂解反應(yīng)釋放游離態(tài)的末端單元及與間苯三酚結(jié)合形成新的復(fù)合物延伸單元[21],用質(zhì)譜信息對(duì)延伸單元進(jìn)行定性,用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各種末端單元、延伸單元和游離單元進(jìn)行定量。果皮和種子中黃烷-3-醇物質(zhì)含量的單位為mg/g,計(jì)算末端單元和延伸單元的總物質(zhì)的量與末端單元的總物質(zhì)的量的比值可得到平均聚合度(mean degree of polymerization,mDP)[22]。黃烷-3-醇定量分別以C、EC、EGC、ECG為外標(biāo)物,計(jì)算4種黃烷-3-醇的含量。果皮和種子中的黃烷-3-醇含量以果實(shí)鮮質(zhì)量表示,單位為mg/kg。標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:

C:y＝965.16x+558.87(y＜20 000),相關(guān)系數(shù)為0.999 7;y＝526.93x+17 110(y≥20 000),相關(guān)系數(shù)為0.997 2;EC:y＝1 407.6x+929.52(y＜30 000),相關(guān)系數(shù)為0.999 2;y＝444.48x+28 086(y≥30 000),相關(guān)系數(shù)為1;ECG:y＝2 850.6x+3 530.3(y＜50 000),相關(guān)系數(shù)為0.998 1;y＝710.51x+137 514(y≥50 000),相關(guān)系數(shù)為0.997 9;EGC:y＝19.42x-28.647,相關(guān)系數(shù)為0.998 1。

HPLC-MS條件:黃烷-3-醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀,色譜柱為Poroshell120 EC-C18column(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)。柱溫55 ℃,進(jìn)樣量1 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,流速0.4 mL/min。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B為加入0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1,V/V)的溶液。洗脫程序:0～28 min,90%～54% A,10%～46% B;28～29 min,54%～90% A,46%～10% B。質(zhì)譜采用電噴霧離子源,負(fù)離子模式,霧化氣壓力為35 psi,干燥氣流速為12 L/h,干燥氣溫度為350 ℃,噴霧電壓為4 kV。采用多反應(yīng)檢測(cè)模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。

1.3.4 葡萄果實(shí)香氣化合物的提取和測(cè)定

取保存于低溫(-40 ℃)冰箱的葡萄果實(shí)50 g,去除果柄和種子,依次加入抑制內(nèi)源糖苷酶活性的0.5 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯和1 g防止氧化的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮,并且破碎至粉末狀;4 ℃靜置浸漬4 h后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上層澄清葡萄汁。參照Lan Yibin等[23]的頂空固相微萃取(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)條件萃取游離態(tài)香氣物質(zhì)。

結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)提取方法參照Lan Yibin等[23]的方法,在活化后的固相萃取柱中加入2 mL葡萄汁,然后依次加入2 mL水和5 mL二氯甲烷,最后糖苷態(tài)香氣物質(zhì)用20 mL甲醇溶液洗脫。收集洗脫后的甲醇溶液,在30 ℃真空條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,使用含0.1 g糖苷酶的檸檬酸/磷酸氫二鉀緩沖液(0.2 mol/L,pH 5)10 mL重新溶解,隨后轉(zhuǎn)移至密閉離心管,37 ℃恒溫酶解16 h。釋放的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)經(jīng)HS-SPME后進(jìn)樣至GC-MS檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次。

HS-SPME條件:準(zhǔn)確稱取1.0 g NaCl放入15 mL進(jìn)樣小瓶,加入5 mL葡萄汁或糖苷水解液和10 μL作為內(nèi)標(biāo)的4-甲基-2-戊醇(1.038 8 g/L),迅速將進(jìn)樣小瓶用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。樣品瓶在40 ℃、500 r/min加熱攪拌30 min,然后將SPME萃取頭插入樣品瓶頂空部分,繼續(xù)40 ℃加熱攪拌30 min。SPME萃取頭在GC進(jìn)樣口(250 ℃)解吸8 min完成進(jìn)樣。

GC-MS條件:參考Wu Yuwen等[24]實(shí)驗(yàn)方法。香氣化合物定性采用自動(dòng)解卷積技術(shù)對(duì)GC-MS全掃描數(shù)據(jù)文件進(jìn)行解卷積分析,根據(jù)各物質(zhì)的保留時(shí)間以及C7～C24正構(gòu)烷烴在相同色譜條件下的保留時(shí)間對(duì)比計(jì)算其相應(yīng)的保留指數(shù),與標(biāo)樣保留指數(shù)、質(zhì)譜圖以及NIST Chemical WebBook文獻(xiàn)中收錄的極性柱條件下測(cè)得的保留指數(shù)比較,差值絕對(duì)值小于50的組分可定性為該化合物。定量方法參考Zhang Mingxia等[25]實(shí)驗(yàn)方法,利用標(biāo)準(zhǔn)樣品香氣物質(zhì)在模擬葡萄汁溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)己有標(biāo)準(zhǔn)樣品的物質(zhì)定量;利用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)樣香氣物質(zhì)對(duì)沒有標(biāo)樣的物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量,樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線均通過相同濃度的4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)對(duì)儀器的響應(yīng)狀態(tài)進(jìn)行矯正。香氣物質(zhì)的含量以果實(shí)鮮質(zhì)量計(jì)算,單位表示為μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 供試葡萄品種(品系)果實(shí)理化指標(biāo)分析

表2 供試葡萄品種（品系）果實(shí)理化指標(biāo)Table 2 Physiochemical parameters of different grape varieties (clones)

釀酒葡萄理化指標(biāo)是決定葡萄酒品質(zhì)高低的關(guān)鍵因素,對(duì)供試葡萄品種(品系)成熟期果實(shí)的可溶性固形物、pH值、可滴定酸(以酒石酸計(jì))和百粒漿果質(zhì)量等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2所示。供試品種的可溶性固形物含量在17.13～20.35 °Brix之間,其中山葡萄的可溶性固形物含量最低。比較果汁的pH值看出,山葡萄和山歐雜種葡萄的pH值普遍低于歐亞種葡萄,尤其是‘雙豐’的pH值最低(2.79)?？傻味ㄋ岬馁|(zhì)量濃度在8.76～20.46 g/L之間,其中‘雙豐’含量最高。百粒漿果質(zhì)量在93.51～176.65 g之間,‘寶石解百納’(176.65 g)百粒漿果質(zhì)量最大,其次是‘赤霞珠’(685),‘雙豐’和‘雙紅’百粒漿果質(zhì)量最小。

2.2 供試葡萄品種(品系)果皮花色苷分析

2.2.1 含量分析

表3 供試葡萄品種（品系）花色苷含量Table 3 Anthocyanin contents of different grape varieties (clones)mg/kg

如表3所示,共檢測(cè)出26 種花色苷,包括未酰化、乙?；⑾愣辊；涂Х弱；幕ㄉ?。在歐亞種葡萄果皮中共檢測(cè)出19 種花色苷,總花色苷含量范圍在400～1 200 mg/kg,其中花色苷總量最多的是‘寶石解百納’(1 100.57 mg/kg);在山葡萄和山歐雜種葡萄中共檢測(cè)到21 種花色苷,其中包括7 種雙糖苷和14 種單糖苷,總花色苷含量最多的是‘雙紅’(2 636.05 mg/kg),其次是‘雙豐’(2 036.64 mg/kg),最少的是‘北冰紅’(772.03 mg/kg)。葡萄果皮中的花色苷總量很大程度上取決于葡萄本身的遺傳信息,對(duì)比3 個(gè)品種類別,可以明顯看出山葡萄果皮花色苷總量顯著高于歐亞種葡萄,而山歐雜種品種‘北冰紅’果皮花色苷總量介于歐亞種葡萄和山葡萄之間。

2.2.2 組成分析

研究表明,歐亞種葡萄常含的花色苷種類主要包括有單糖苷化的花青素、花翠素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的3-葡萄糖苷衍生物[26-31],而非歐亞種葡萄含有花色素雙糖苷[32],典型的非歐亞種葡萄如山葡萄均含有花色素雙糖苷[33]。在本研究檢測(cè)到的花色苷種類中,歐亞種葡萄檢測(cè)到的花色苷都是單糖苷,其中非?；? 種、乙酰化5 種、香豆?；? 種、咖啡?；? 種,含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷,在‘赤霞珠’338中沒有檢測(cè)到甲基花青素-3-O-咖啡?；咸烟擒?。在有山葡萄遺傳背景的4 個(gè)品種中共檢測(cè)到了7 種花色素雙糖苷,分別為二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-香豆?；咸烟擒?5-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、甲基花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷、花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷,且二甲花翠素-3-O-香豆?；咸烟擒?5-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-乙?；咸烟擒?5-O-葡萄糖苷只在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測(cè)到,這7 個(gè)雙糖苷中含量最高的是二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷;而在山葡萄遺傳背景的4 個(gè)品種中都沒有檢測(cè)到花青素的單糖苷,在山葡萄品種‘雙豐’、‘雙優(yōu)’和‘雙紅’中都沒有檢測(cè)到?；幕ㄉ?。

比較花色苷含量的組成(圖1),3 個(gè)歐亞種葡萄均是由非?；⒁阴；?、咖啡?；拖愣辊；幕ㄉ战M成,而3 個(gè)山葡萄品種均只檢測(cè)到非?；幕ㄉ?山歐雜種品種‘北冰紅’同時(shí)檢測(cè)到非酰化、乙酰化和香豆?；幕ㄉ??？傮w來看4 種花色苷含量占總花色苷含量的比例為非?；疽阴；究Х弱；鞠愣辊；?‘雙優(yōu)’、‘雙紅’、‘雙豐’和‘北冰紅’中沒有檢測(cè)到咖啡?；幕ㄉ?香豆酰化的花色苷所占比例在4 種花色苷中最低。香豆?；幕ㄉ蘸吭谄贩N間差異較大,其中含量最高的是山歐雜種品種‘北冰紅’(24%),其次是歐亞種葡萄,山葡萄中不含有香豆酰化的花色苷。非酰化的花色苷在山葡萄和山歐雜種葡萄中的比例高于歐亞種葡萄,均大于70%。

在本研究中,由于只在山葡萄和山歐雜種葡萄中檢測(cè)到花色素雙糖苷,分析其5 類花色苷中單雙糖苷的比例如圖2所示,這4 個(gè)品種主要是以花色素雙糖苷為主。在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測(cè)到少量的花青素類單糖苷,而在山葡萄品種‘雙優(yōu)’、‘雙紅’和‘雙豐’中并未檢測(cè)到花青素類單糖苷,且在‘北冰紅’中檢測(cè)到的甲基花翠素類和二甲花翠素類單糖苷的含量顯著高于3 個(gè)山葡萄品種。在3 個(gè)山葡萄品種中,5 類花色素雙糖苷的比例遠(yuǎn)高于花色素單糖苷,在山葡萄和山歐雜種葡萄中最主要的花色素雙糖苷是二甲花翠素類的雙糖苷。

圖1 不同葡萄品種（品系）花色苷組成比例Fig. 1 Anthocyanin composition of different grape varieties (clones)

圖2 山葡萄和山歐雜種葡萄單雙糖苷組成比例Fig. 2 Proportions of mono-and bis-glucosidic anthocyanins in V. amurensis and interspecific hybrid of V. vinifera and V. amurensis

2.3 供試葡萄品種(品系)果皮黃酮醇分析

2.3.1 含量分析

表4 供試葡萄品種（品系）黃酮醇含量Table 4 Flavonol contents of different grape varieties (clones)mg/kg

如表4所示,共檢測(cè)到12 種黃酮醇化合物,其中包括楊梅酮類(3 種)、槲皮素類(4 種)、西伯利亞落葉松黃酮(1 種)、山柰酚類(2 種)、異鼠李素(1 種)和丁香亭(1 種)。在歐亞種葡萄和山歐雜種葡萄中12 種黃酮醇化合物均被檢測(cè)到,而在山葡萄品種‘雙優(yōu)’、‘雙紅’和‘雙豐’中沒有檢測(cè)到山柰酚類化合物,在‘雙豐’葡萄中只檢測(cè)到4 種黃酮醇,分別為楊梅酮-3-O-半乳糖苷、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷和楊梅酮-3-O-葡萄糖醛酸苷。不同品種總黃酮醇含量差異較大,山葡萄總黃酮醇含量顯著高于歐亞種葡萄;山歐雜種品種‘北冰紅’總黃酮醇含量顯著高于歐亞種葡萄‘赤霞珠’,而與‘寶石解百納’差異不顯著;其中總量最多的是‘雙紅’(399.77 mg/kg),總量最少的是‘赤霞珠’(338)(83.37 mg/kg);在山葡萄中含量最多的化合物是楊梅酮-3-O-半乳糖苷,約占總量的2/3。

2.3.2 組成分析

對(duì)供試葡萄品種(品系)果皮中不同種類黃酮醇占總黃酮醇的比例進(jìn)行分析(圖3),7 個(gè)品種中共檢測(cè)到了在葡萄果實(shí)中存在的6 種糖苷配基,分別為楊梅酮、槲皮素、山柰酚、西伯利亞落葉松黃酮、異鼠李素和丁香亭,其中楊梅酮類和槲皮素類黃酮醇含量最多。在歐亞種葡萄中槲皮素類黃酮醇占總黃酮醇比例最高,其中‘赤霞珠’最高且都大于70%;而與歐亞種葡萄相比,山葡萄和山歐雜種葡萄中含量最多的是楊梅酮類黃酮醇,尤其是‘雙紅’和‘雙豐’,其比例高達(dá)88%;其中‘雙豐’只含有楊梅酮、槲皮素兩類黃酮醇。山歐雜種品種‘北冰紅’與歐亞種葡萄相比,其楊梅酮類黃酮醇含量明顯高于歐亞種葡萄,約占總量的55%;與3 個(gè)山葡萄品種相比,其西伯利亞落葉松黃酮、異鼠李素、丁香亭和山柰酚類黃酮醇含量明顯高于山葡萄?？梢?具有歐亞種葡萄血緣和山葡萄血緣的‘北冰紅’,其各類黃酮醇含量介于兩者之間。

圖3 不同葡萄品種（品系）黃酮醇組成比例Fig. 3 Flavonol composition of different grape varieties (clones)

2.4 供試葡萄品種(品系)果皮和種子黃烷-3-醇含量和組成分析

如表5、6所示,葡萄果皮中游離黃烷-3-醇主要包括3 個(gè)基本單元,分別為C、EC和EGC。比較游離單元、末端單元和延伸單元可知,延伸單元所占比例最高,接近90%,延伸單元主要由EC組成,其次是EGC,ECG和C的含量較低。檢測(cè)成熟期葡萄果皮中黃烷-3-醇發(fā)現(xiàn),EGC、C和EC均可作為末端單元,并且C是主要的末端單元,其次是EGC。相比于歐亞種葡萄果皮中的黃烷-3-醇總量,山葡萄和山歐雜種葡萄中的黃烷-3-醇遠(yuǎn)低于歐亞種葡萄,其中含量最少的是‘雙紅’(224.75 mg/kg)。比較mDP可知,歐亞種葡萄的平均聚合度高于山葡萄,其中最高的是‘赤霞珠’(685)(104.47),該結(jié)果與韓梅梅等[22]研究結(jié)果不同,可能是由于產(chǎn)地、年份等生態(tài)環(huán)境不同的原因,而山葡萄果皮中黃烷-3-醇的mDP都小于20,最低的是‘雙優(yōu)’(7.81)。

葡萄種子中檢測(cè)到的游離黃烷-3-醇主要包括C、EC、ECG和EGC 4 種基本單元。在種子的黃烷-3-醇中延伸單元所占比例最高,延伸單元主要是由EC組成,其次是ECG,而EGC和C含量很少。檢測(cè)成熟期葡萄種子中黃烷-3-醇發(fā)現(xiàn),EGC、C和EC均可作為末端單元,并且C是主要的末端單元,其次EGC。其中,山葡萄種子中的黃烷-3-醇總量差異較大,最多的是‘雙紅’(6 705.55 mg/kg),最低的是‘雙豐’(2 0 9 7.5 1 m g/k g)。一般來說,在歐亞種葡萄中,種子中的mDP低于果皮,但是計(jì)算成熟期種子的黃烷-3-醇的mDP可知,‘寶石解百納’種子的mDP(45.98)高于葡萄果皮中的(19.1)。而山葡萄品種‘雙豐’、‘雙紅’和‘雙優(yōu)’與山歐雜種品種‘北冰紅’的種子mDP遠(yuǎn)高于果皮,差別最大的是‘雙優(yōu)’,在種子中的mDP能達(dá)到128.39,但在果皮中的mDP卻為7.81,表現(xiàn)出與歐亞種葡萄明顯的不同。相比之下,‘北冰紅’因?yàn)楹袣W亞種葡萄血緣,種子與果皮中的mDP的差異不是特別大,但是種子的mDP(45.07)還是高于果皮(28.64)。

表5 供試葡萄品種（品系）果皮黃烷-3-醇含量Table 5Flavanol-3-ol contents in the skin of different grape varieties (clones)mg/kg

表6 供試葡萄品種（品系）種子黃烷-3-醇含量Table 6Flavanol-3-ol contents in the seeds of different grape varieties (clones)mg/kg

2.5 供試葡萄品種(品系)果實(shí)香氣物質(zhì)含量和組成分析

采收期供試葡萄品種(品系)果實(shí)中香氣化合物組成復(fù)雜,這些香氣化合物以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)的形式存在,共66 種;根據(jù)其化學(xué)機(jī)構(gòu)的不同可分為酸類(2 種)、醇類(9 種)、苯類(2 種)、C6/C9類(13 種)、羰基化合物(7 種)、酯類(16 種)、降異戊二烯類(1 種)、萜烯類(5 種)以及其他(11 種)。表7和表8分別表示供試葡萄品種(品系)果實(shí)中游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量。

供試葡萄品種(品系)果實(shí)中共檢測(cè)到58 種游離態(tài)香氣物質(zhì),在7 個(gè)不同品種(品系)中C6/C9類是游離態(tài)香氣物質(zhì)中含量最豐富的化合物,如圖4A所示,占總游離香氣物質(zhì)含量的比值均在85%以上;C6/C9類化合物能夠提供青草香,對(duì)葡萄酒的香氣非常重要,在檢測(cè)出的C6/C9類香氣物質(zhì)中以(E)-2-己烯醛的含量最高,它也決定了葡萄果實(shí)游離態(tài)C6/C9類香氣物質(zhì)的含量。其中山葡萄的C6/C9類香氣物質(zhì)含量顯著高于歐亞種葡萄和山歐雜種葡萄,含量最高的是‘雙豐’(23 991.12 μg/kg),含量最低的是‘北冰紅’(10 499.01 μg/kg)。其次游離態(tài)香氣物質(zhì)中含量最豐富的化合物是酯類,含量比值范圍在3%～8%之間。

供試葡萄品種(品系)果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)共檢測(cè)到45種,其中醇類是‘赤霞珠’(338)、‘寶石解百納’、‘雙豐’和‘北冰紅’葡萄果實(shí)中最主要的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì),如圖4B所示,占總結(jié)合香氣物質(zhì)含量的30%以上;‘赤霞珠’(685)中含量最豐富的是C6/C9類和萜烯類香氣物質(zhì),以及其他類型香氣化合物;酯類物質(zhì)在‘雙優(yōu)’和‘雙紅’中含量最高,分別為1 236.64、1 160.9 μg/kg,分別占總結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的41%、26%;而C6/C9類香氣物質(zhì)在‘雙豐’中含量最多,為1 241.41 μg/kg,占總結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的34%。綜上,山葡萄的C6/C9類香氣物質(zhì)含量顯著高于歐亞種葡萄。因此,C6/C9類香氣物質(zhì)含量的多少可以作為區(qū)分山葡萄和歐亞種葡萄的依據(jù)。

表7 供試葡萄品種（品系）果實(shí)游離態(tài)香氣物質(zhì)含量Table 7 Contents of free aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

表8 供試葡萄品種（品系）果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量Table 8 Contents of conjugated aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

圖4 不同葡萄品種（品系）果實(shí)游離態(tài)香氣物質(zhì)（A）和結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)（B）組成比例Fig. 4 Composition of free (A) and conjugated (B) aroma compounds in different grape varieties (clones)

3 結(jié) 論

本研究通過對(duì)7 個(gè)釀酒葡萄(來源于歐亞種葡萄、山葡萄和山歐雜種葡萄)果實(shí)類黃酮及香氣物質(zhì)含量和組成的測(cè)定,明確了不同種葡萄之間的差異。其中,山葡萄花色苷總量顯著高于歐亞種與山歐雜種葡萄;在山葡萄中未檢測(cè)出酰化的花色苷;在歐亞種葡萄中只檢測(cè)出花色素單糖苷;在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測(cè)到2 種?；幕ㄉ仉p糖苷。在黃酮醇方面,山葡萄黃酮醇總量顯著高于歐亞種與山歐雜種葡萄;山葡萄和歐亞種葡萄分別以楊梅酮類和槲皮素類黃酮醇含量最多;在山葡萄品種中均未檢測(cè)出山柰酚類黃酮醇。對(duì)比分析葡萄果皮和種子中的黃烷-3-醇及其mDP,歐亞種葡萄果皮中的黃烷-3-醇總量顯著高于山葡萄與山歐雜種葡萄;歐亞種葡萄果皮的mDP高于種子的mDP,而山葡萄和山歐雜種葡萄則相反。果實(shí)香氣方面,C6/C9類香氣物質(zhì)的含量占香氣總量的比值最大;山葡萄中C6/C9類香氣物質(zhì)的含量顯著高于歐亞種葡萄。綜上所述,不同種葡萄果實(shí)類黃酮及香氣物質(zhì)含量和組成的差異明顯,未來可以將這些差異指標(biāo)作為區(qū)分歐亞種葡萄、山葡萄和山歐雜種葡萄的理論依據(jù)。