朱耀磊,侯紅漫,張公亮,郝洪順

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 大連 116034;2.洛陽(yáng)師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471934;3.遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116034)

群體感應(yīng)是細(xì)菌間交流的一種方式,通過分泌到胞外的信號(hào)分子進(jìn)行[1]。革蘭氏陰性菌間的群體感應(yīng)是由高絲氨酸內(nèi)酯類(N-acylhomoserine lactones,AHLs)介導(dǎo),其中LuxR/I系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌中較為典型的模式群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)。luxI基因編碼AHLs合成酶,調(diào)控AHLs的合成,當(dāng)環(huán)境中的菌群數(shù)量達(dá)到一定密度時(shí),合成的AHLs會(huì)分泌到胞外,AHLs濃度達(dá)到一定的閾值后,會(huì)進(jìn)入胞內(nèi),與LuxR蛋白結(jié)合,激活細(xì)菌的LuxR/I調(diào)控系統(tǒng),進(jìn)而對(duì)下游相關(guān)基因控制的性狀進(jìn)行調(diào)控[1-2]。研究表明,細(xì)菌的群體感應(yīng)LuxR/I系統(tǒng)對(duì)胞外蛋白酶的分泌、生物被膜的形成、泳動(dòng)性以及生物發(fā)光等性狀具有調(diào)控作用[2]。

蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧菌,屬于腸桿菌科的條件性致病菌,有鞭毛,能運(yùn)動(dòng),適應(yīng)生長(zhǎng)的溫度范圍較廣(4～42 ℃),因此廣泛分布于自然環(huán)境中[3]?，F(xiàn)階段對(duì)H. alvei的研究,主要圍繞其作為食品腐敗菌進(jìn)行。據(jù)報(bào)道,H. alvei經(jīng)常分離自低溫冷藏的牛肉、雞肉、原料乳、真空包裝、低溫貯藏的肉制品以及生鮮海產(chǎn)品中[4-6],并在這些產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)中扮演著重要角色。研究表明該菌具有較強(qiáng)的群體感應(yīng)活性,能夠分泌多種AHLs,對(duì)其致腐特性具有潛在的調(diào)控作用[7]。

生物被膜是細(xì)菌為抵抗外界環(huán)境的變化而形成,為其本身的一種自我保護(hù)機(jī)制。它是細(xì)菌分泌的胞外多糖,可以茹附到接觸物體的表面,進(jìn)而茹連并包裹自身細(xì)胞,并促進(jìn)細(xì)菌的傳播和污染[8]。研究表明,H. alvei具有形成強(qiáng)生物被膜的能力[7-8],能夠在與食品接觸的器械表面形成,進(jìn)而在加工過程中進(jìn)入到食品中,導(dǎo)致食品在貯存過程中發(fā)生腐敗變質(zhì)。通過研究H. alvei群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)生物被膜形成的調(diào)控作用,以更好地控制H. alvei在食品加工過程中的污染和傳播,減少由其造成的食品腐敗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H. alvei H4野生型菌株分離自腐敗即食海參;luxRI基因缺失型H. alvei株?luxRI,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,詳見Zhu Yaolei等[9]方法;紫色桿菌CV026菌株(Chromobacterium violaceum 026)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院周志剛教授惠贈(zèng),用于檢測(cè)AHLs;實(shí)驗(yàn)菌株均用LB培養(yǎng)基在30 ℃條件下培養(yǎng)。其中培養(yǎng)?luxRI菌株時(shí)需添加20 μg/mL的氯霉素。

氯霉素 北京索萊寶科技有限公司;無水甲醇、冰醋酸(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;結(jié)晶紫 生工生物工程(上海)股份有限公司;RNA提取試劑盒(DP430) 天根生化科技有限公司;SYBR Green I Ex Taq酶(RR420)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047) 寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 2102分光光度計(jì) 日本島津公司;M2酶標(biāo)儀美國(guó)分子儀器有限公司;7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;PCR儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司;場(chǎng)發(fā)射掃面電鏡 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取H. alvei H4和?luxRI菌株過夜培養(yǎng)的菌液1 mL,分別接種到滅菌的液體100 mL LB培養(yǎng)基中,于160 r/min、30 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定其OD600nm。

1.3.2 AHLs的測(cè)定

采用報(bào)告平板法測(cè)定H. alvei H4和?luxRI菌株AHLs[10]。

AHLs的提取:取100 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alvei H4和?luxRI菌株的菌液,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,取上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至10 mL,加入30 mL 1%甲酸溶液酸化的乙酸乙酯,充分振蕩混均勻后靜置3 h。取上層溶液蒸干,加入1 mL超純水充分溶解,取出后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

AHLs檢測(cè):取10 mL過夜培養(yǎng)的紫色桿菌CV026菌液,加入到冷卻至60 ℃左右的固體LB培養(yǎng)基中,混勻,傾注到平板中,待其凝固,用1 mL槍頭頂端在平板中央打孔,隨后加入60 μL AHLs提取液,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)孔周圍有無紫色變化,判斷AHLs是否存在。

1.3.3 生物被膜的測(cè)定

1.3.3.1 結(jié)晶紫染色方法測(cè)定生物膜形成

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alvei H4和?luxRI菌株的菌液用LB溶液按1∶100比例稀釋,分別吸取200 μL稀釋后的菌液加入到96 孔板中,30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,測(cè)定其OD600nm,之后棄去孔中菌液,每孔加入250 μL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3 遍。隨后加入250 μL無水甲醇固定15 min,棄去孔中廢液,置于60 ℃烘箱中烘干。取出冷卻后,加入250 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min,然后棄去廢液,用去離子水清洗3 遍,洗去殘余的結(jié)晶紫溶液,60 ℃烘干,加入200 μL 33%冰醋酸溶液,在96 孔板振蕩器上振蕩15 min。最后讀取其590 nm波長(zhǎng)處吸光度[8]。以O(shè)D590nm/OD600nm表示生物膜的形成。

1.3.3.2 生物被膜掃描電鏡觀察

將玻璃蓋片(1 cm×1 cm)用洗滌劑清洗干凈后,置于HCl溶液中過夜浸泡,去離子水清洗干凈,放入平板中滅菌,備用。將處理好的玻璃蓋片置于24 孔板中,加入1.3.3.1節(jié)稀釋好的菌液,培養(yǎng)48 h,從24 孔板中取出玻片,用滅菌的0.1 mol/L PBS充分清洗,洗掉浮游細(xì)菌,再用2.5%戊二醛-PBS過夜固定,之后用PBS沖洗數(shù)遍,隨后用1%鋨酸溶液固定1 h,依次用50%、70%、80%、90%乙醇溶液脫水10 min,無水乙醇脫水2 次,每次15 min,再經(jīng)乙酸異戊酯置換2 次,每次15 min,臨界點(diǎn)干燥儀干燥,取出后噴金,掃描電鏡進(jìn)行觀察[11-12]。

1.3.4 泳動(dòng)性的測(cè)定

將滅菌好的泳動(dòng)性培養(yǎng)基傾注到平板中,每個(gè)平板20 mL。平板凝固后,用移液器吸取3 μL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alveiH4和?luxRI菌株的菌液,點(diǎn)到泳動(dòng)性平板中央,小心移至30 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)[13]。

1.3.5 生物膜相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)測(cè)定

1.3.5.1 RNA的提取

取1 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alveiH4和?luxRI菌株的菌液,離心并棄去上清液,用滅菌的0.1 mol/L PBS清洗菌體沉淀2 次,離心棄去上清液。根據(jù)天根RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,提取RNA。

1.3.5.2 cDNA的合成

分別取500 ng上述提取的RNA,利用寶生物的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA,稀釋10 倍作為real-time PCR的模板。

1.3.5.3 real-time PCR條件及體系

采用real-time PCR測(cè)定群體感應(yīng)LuxR/I系統(tǒng)對(duì)H. alvei生物膜和泳動(dòng)性相關(guān)基因flgA、flgE、fliA、flhD、flhC表達(dá)量的變化。反應(yīng)體系20 μL:1.6 μL cDNA,0.4 μL上下游引物,7.6 μL DEPC水,10 μL SYBR Green IEx Taq酶。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,59 ℃退火31 s,40 個(gè)循環(huán)。16S rRNA作為內(nèi)參基因,采用2-??Ct的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[14]。real-time PCR引物信息見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1Primers used for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 H. alvei H4和?luxRI菌株的生長(zhǎng)曲線

圖1 H. alvei H4和ΔluxRI菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of H. alvei H4 and ΔluxRI

由圖1可知,H. alveiH4的群體感應(yīng)相關(guān)基因luxRI敲除后,該菌的生長(zhǎng)狀況在對(duì)數(shù)期略低于野生型菌株,在對(duì)數(shù)后期,2 株菌的生長(zhǎng)密度達(dá)到一致,進(jìn)入到穩(wěn)定期后,二者的生長(zhǎng)狀況保持相同,無明顯差別。

2.2 H. alvei H4和?luxRI菌株AHLs產(chǎn)生對(duì)比

圖2 H. alvei H4和ΔluxRI菌株AHLs的產(chǎn)生Fig. 2 Production of AHLs by H. alvei H4 and ΔluxRI

如圖2所示,在添加有H. alveiH4 AHLs提取液的平板中央出現(xiàn)了一個(gè)圓形的紫色區(qū)域,表明生長(zhǎng)在瓊脂中的紫色桿菌CV026受到AHLs的誘導(dǎo)作用產(chǎn)生了紫色素,進(jìn)而說明H. alveiH4能夠產(chǎn)生AHLs。而在加有?luxRI菌株提取液的平板則與對(duì)照相同,其中央則沒有發(fā)現(xiàn)紫色區(qū)域,表明?luxRI菌株不能產(chǎn)生AHLs。

2.3 生物被膜的形成

圖3 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜的形成Fig. 3 Biofilm formation of H. alvei H4 and ΔluxRI

圖4 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 4 Biofilm formation of H. alvei H4 and ΔluxRI revealed by SEM

如圖3所示,luxRI基因缺失后,?luxRI菌株形成生物膜的能力顯著低于H. alveiH4(P＜0.05)。圖4A1顯示,茹附在玻片表面的細(xì)菌數(shù)量較多,而圖4B1中茹附在玻片上?luxRI菌株數(shù)量明顯減少。并且對(duì)比圖4A2、B2可知,H. alveiH4能夠產(chǎn)生大量胞外多糖,茹附在玻片表面形成較厚的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生物膜,而?luxRI菌株分泌的胞外多糖相比于H. alveiH4則明顯減少,形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并不明顯。

2.4 泳動(dòng)性的變化

圖5 H. alvei H4（A）和ΔluxRI（B）菌株的泳動(dòng)性Fig. 5 Swimming motilities of H. alvei H4 (A) and ΔluxRI (B)

圖6 H. alvei H4和ΔluxRI菌株在泳動(dòng)性平板上的擴(kuò)散直徑Fig. 6 Diffusion diameters of H. alvei H4 and ΔluxRI strains spread on swimming plates

圖5 顯示,H. alveiH4在泳動(dòng)性平板表面培養(yǎng)48 h后,能夠向四周擴(kuò)散,形成圓形的暈圈,表明該菌具有運(yùn)動(dòng)性。?luxRI菌株同樣可以在泳動(dòng)性平板表面擴(kuò)散,然而其擴(kuò)散形成圓形暈圈明顯小于H. alveiH4。圖6表明,在培養(yǎng)相同時(shí)間的條件下,?luxRI菌株的擴(kuò)散半徑明顯(P＜0.05)小于野生型H. alveiH4,即其泳動(dòng)性受到顯著抑制。

2.5 生物膜和泳動(dòng)性相關(guān)基因的表達(dá)

2.5.1 RNA的提取

圖7 H. alvei H4和ΔluxRI菌株RNA的提取結(jié)果Fig. 7 Electrophoregram of RNA isolated from H. alvei H4 and ΔluxRI

RNA提取結(jié)束后,經(jīng)電泳檢測(cè)(圖7),在泳道1和2均有兩條明亮的條帶,并且條帶清晰、完整,沒有發(fā)生降解現(xiàn)象,經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè),OD260nm/OD280nm值在2.0左右,質(zhì)量濃度均高于200 ng/μL。可用于接下來的cDNA合成。

2.5.2 基因表達(dá)的變化

圖8 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜和泳動(dòng)性相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 8 Relative expression levels of biofilm- and motility-related genes in H. alvei H4 and ΔluxRI

如圖8所示,H. alvei群體感應(yīng)相關(guān)基因luxRI缺失后,其生物膜和泳動(dòng)性相關(guān)基因flgA、flgE、fliA、flhD和flhC相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)。其中flgE基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了近65%,變化最大。其次是flhC基因,下調(diào)了近50%。fliA基因下調(diào)了約40%,flgA和flhD基因的相對(duì)表達(dá)量較f l gE、f l iA和f l hC基因變化較小,下調(diào)了近25%。

3 討 論

研究表明,AHLs是由AHLs合成酶合成的,編碼基因?yàn)閘uxI,當(dāng)luxI缺失后,細(xì)菌本身無法產(chǎn)生AHLs,因此細(xì)菌間的交流會(huì)受到影響,進(jìn)而導(dǎo)致受群體感應(yīng)調(diào)控性狀的變化[15]。當(dāng)H. alveiH4的luxRI基因敲除后,該菌無法產(chǎn)生AHLs(圖2),Liu Li等[16]報(bào)道中同樣得出相似的結(jié)論。生物被膜的形成主要包括5 個(gè)階段,分別為初始茹附、表面附著、形成初期、成熟期和脫落期,其中細(xì)菌的泳動(dòng)性直接影響生物膜形成的第一個(gè)階段,與介質(zhì)表面的接觸[8,17],H. alvei H4在luxRI基因敲除后,其泳動(dòng)性顯著降低(圖5、6),從而影響了細(xì)菌與介質(zhì)表面的接觸,進(jìn)一步導(dǎo)致生物膜形成的減少。在Khajanchi等[18]研究中,同樣發(fā)現(xiàn)Aeromonas hydrophila菌的群體感應(yīng)AhyRI系統(tǒng)的缺失,會(huì)顯著抑制該菌生物膜形成和泳動(dòng)性;同時(shí),Oh等[19]研究發(fā)現(xiàn)將Acinetobacter nosocomialis菌株群體感應(yīng)相關(guān)anoR基因敲除后,亦會(huì)導(dǎo)致該菌株生物被膜形成的顯著性降低。上述學(xué)者的研究與本研究結(jié)論相同。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性主要依賴于其本身的鞭毛的移動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)[20],根據(jù)Lee[21]、Wang Yao[22]、陳雪鳳[23]等報(bào)道,fliA、flhD和flhC為鞭毛轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,這些基因的缺失均會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生物膜形成和泳動(dòng)性受到抑制,flgA和flgE為細(xì)菌鞭毛合成蛋白的編碼基因,直接反映細(xì)菌鞭毛的合成狀況,影響生物膜形成和泳動(dòng)性。本研究H. alvei H4群體感應(yīng)LuxR/I系統(tǒng)的缺失,使得f l gA、f l gE、fliA、flhD和flhC基因的相對(duì)表達(dá)量被顯著抑制(圖8),表明上述基因的表達(dá)受該菌群體感應(yīng)的調(diào)控,并進(jìn)一步調(diào)控生物膜的形成和泳動(dòng)性。Atkinson等[24]報(bào)道表明,Yersinia pseudotuberculosis菌株泳動(dòng)性的變化是其群體感應(yīng)YpsRI和YtbRI系統(tǒng)通過調(diào)控flhD/C和fliA基因?qū)崿F(xiàn)的。在對(duì)Sinorhizobium meliloti菌株群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究中[25],發(fā)現(xiàn)當(dāng)其群體感應(yīng)相關(guān)基因sinI缺失后,泳動(dòng)性基因flaA和flaB的表達(dá)受到抑制。在對(duì)Pseudomonas fluorescens KM120[26]和Agrobacterium tumefaciens[21]的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)其群體感應(yīng)系統(tǒng)受到抑制而影響生物膜形成時(shí),flgA和flgE基因的表達(dá)同樣受到抑制作用。同樣的,在關(guān)于Acidovorax citrulli[27]和Enterococcus faecalis[28]菌株群體感應(yīng)調(diào)控作用的研究中,均表明生物膜、泳動(dòng)性及相關(guān)基因的表達(dá)亦受到群體感應(yīng)的調(diào)控作用,研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。

在對(duì)由細(xì)菌導(dǎo)致的食品腐敗的研究中,群體感應(yīng)己逐漸成為一個(gè)不可忽略的因素[29],根據(jù)研究結(jié)果,H. alvei H4群體感應(yīng)LuxR/I系統(tǒng)對(duì)該菌生物被膜的形成和泳動(dòng)性具有顯著的調(diào)控作用,因此可以通過作用于群體感應(yīng)系統(tǒng),進(jìn)而控制生物膜的形成以減少腐敗細(xì)菌在食品加工過程中的傳播和污染。近年來,越來越多的研究集中于群體感應(yīng)抑制劑[30],能夠在不抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的條件下,通過影響細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng),進(jìn)而抑制細(xì)菌生物膜、泳動(dòng)性等腐敗相關(guān)特性,達(dá)到控制腐敗的作用。本研究為控制H. alvei在食品加工過程中生物膜的形成,減少由其造成的食品污染和腐敗提供了新的理論支持。