盧海強(qiáng),陳 偉,黃 蕾,谷新晰,田洪濤

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071000)

單寧酶(EC 3.1.1.20)是可將單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵斷裂,生成葡萄糖和沒食子酸等物質(zhì)一類酶的總稱,在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[1-2]。雖然對(duì)單寧酶的研究廣泛且具有較長(zhǎng)歷史,但是到目前為止,主要集中在產(chǎn)酶微生物的篩選及產(chǎn)酶特性分析方面[3-5]。單寧酶蛋白往往需要形成二硫鍵、氨基酸的糖基化及蛋白的正確折疊等表達(dá)后加工,才能夠成為具有活性的酶蛋白分子[6-7],這使得僅有數(shù)個(gè)單寧酶基因被克隆并表達(dá),涉及的微生物有米曲霉、黑曲霉、植物乳桿菌等[8-11]。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為優(yōu)良的表達(dá)宿主,己經(jīng)實(shí)現(xiàn)了上百種酶基因的高效表達(dá)[12],探究影響單寧酶在巴斯德畢赤酵母正確表達(dá)因素的意義重大。

本課題組前期從濃香大曲中篩選獲得產(chǎn)單寧酶嗜熱真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HBHF5,該菌屬條件致病菌,具有一定潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。巴斯德畢赤酵母GS115菌株為畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)常用菌株,其生理學(xué)背景清楚,屬于安全菌株。為此,將煙曲霉菌株中的單寧酶afTanA基因在巴斯德畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)的重組單寧酶(AfTanA)由2 個(gè)30 kDa左右大小亞基組成,且酶的穩(wěn)定性降低,推測(cè)這些性質(zhì)的改變與Kex2蛋白酶作用相關(guān)[13-14]。單寧酶中普遍含有1～2 個(gè)Kex2位點(diǎn),到目前為止,只有Koseki等[15]對(duì)米曲霉來源的單寧酶中Kex2位點(diǎn)進(jìn)行了研究,而單寧酶AfTanA中Kex2位點(diǎn)對(duì)酶學(xué)特性影響還不清楚。因此,亟待深入開展Kex2位點(diǎn)對(duì)單寧酶AfTanA性質(zhì)影響的研究工作。

本研究以前期獲得的重組單寧酶AfTanA為材料,構(gòu)建AfTanA蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型,分析Kex2位點(diǎn)在單寧酶蛋白結(jié)構(gòu)中的位置及其作用;對(duì)比單點(diǎn)突變體(R316A)和雙點(diǎn)缺失突變體(ΔRK:Lys315-Arg316)酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用效果的差異,探討Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)對(duì)該酶酶學(xué)性質(zhì)及在柿子汁應(yīng)用效果的影響,以期為單寧酶的生產(chǎn)及性能改造提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pMDTM19T-afTanA質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建并提供;巴斯德畢赤酵母GS115菌株、pPIC9k質(zhì)粒 美國Invitrogen公司;FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SpeI、NotI和SalI大連寶生物有限公司;沒食子酸丙酯 浙江匝?；ぴ噭S;羅丹寧 生工生物工程(上海)股份有限公司;單寧酸 上海化學(xué)試劑公司;其他試劑均為分析純。

營養(yǎng)肉湯(Luria Broth,LB)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基、最少葡萄糖(minimal dextrase,MD)瓊脂培養(yǎng)基、甘油(buffered glycerol,BMGY)培養(yǎng)基和甲醇誘導(dǎo)(buffered methanol,BMMY)培養(yǎng)基參照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊(cè)配制。

1.2 儀器與設(shè)備

立式高速低溫離心機(jī) 中國湘儀離心機(jī)公司;Tprofessional聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 德國Biometra公司;TU-1810紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;細(xì)胞電穿孔儀 美國伯樂公司;JY04S-3E型凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AfTanA中Kex2酶切位點(diǎn)及其作用分析

使用蛋白質(zhì)在線建模軟件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)構(gòu)建AfTanA突變體的三維結(jié)構(gòu)模型,通過PyMOL軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析。使用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行Kex2位點(diǎn)氨基酸序列比對(duì)分析。使用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)軟件預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照前期獲得的單寧酶afTanA基因序列信息(XP_746534.1),依據(jù)Fast MultiSite Mutagenesis System要求設(shè)計(jì)單寧酶afTanA中Kex2位點(diǎn)突變引物,如表1所示,突變引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.3 Kex2突變基因的構(gòu)建

以pMDTM19T-afTanA質(zhì)粒為模板,PCR參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸4 min,25 個(gè)循環(huán);72 ℃保溫10 min。參照Fast MultiSite Mutagenesis System說明書進(jìn)行單寧酶afTanA基因Kex2位點(diǎn)的定點(diǎn)突變,分別構(gòu)建pMDTM19T-afTanR316A和pMDTM19T-afTanΔKR突變質(zhì)粒,將陽性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 單寧酶突變體的構(gòu)建

分別將pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR和pPIC-9k質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,利用膠回收試劑盒對(duì)目的酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收,進(jìn)行afTanA和pPIC-9k的連接反應(yīng),分別構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-afTanR316A和pPIC9kafTanΔKR。采用5’AOX和3’AOX通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證,將篩選重組表達(dá)質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序鑒定。

測(cè)序正確的pPIC9k-afTanR316A和pPIC9k-afTanΔKR質(zhì)粒經(jīng)Sal I將表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理后,電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,利用酶活力篩選方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選,獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.5 誘導(dǎo)表達(dá)及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

挑取單陽性轉(zhuǎn)化子至50 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h。以1%的接種量接種于200 mL BMGY中,在搖床中30 ℃、250～300 r/min生長(zhǎng)至OD600nm為2～6(約16～18 h),室溫、8 000×g離心5 min收集細(xì)胞,去除上清液,100 mL BMMY重懸細(xì)胞,放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,維持甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%,離心收集發(fā)酵液,即為粗酶液,進(jìn)行酶活力測(cè)定及SDS-PAGE分析。

1.3.6 單寧酶酶學(xué)性質(zhì)分析

酶活力測(cè)定參考Sharma等[16]的方法。取100 μL適當(dāng)稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液(1.25 mmol/L,pH 5.0)混勻,于25 ℃條件反應(yīng),10 min后加入300 μL羅丹寧終止反應(yīng),加入200 μL的KOH(0.5 mol/L)溶液顯色,穩(wěn)定5 min后在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.6.1 pH值對(duì)突變體酶活力的影響

分別測(cè)定突變體AfTanR316A和AfTanΔKR酶液樣品在不同pH值緩沖液體系(pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0)中的酶活力,確定其最適反應(yīng)pH值。將突變體AfTanR316A和AfTanΔKR在pH 2.0～12.0的條件下,37 ℃處理1 h,對(duì)照為未進(jìn)行處理的酶,按照標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定方法測(cè)定酶活力,以未加金屬離子和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的酶活力計(jì)為100%,分析其pH值耐受性。

1.3.6.2 溫度對(duì)突變體酶活力的影響

將突變體AfTanR316A和AfTanΔKR在最適pH值下,分別測(cè)定0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃反應(yīng)溫度下的酶活力,確定其最適溫度。將重組酶在40 ℃和50 ℃條件下,孵育0、5、10、20、30 min和60 min后,測(cè)定酶活力,分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.6.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,分別測(cè)定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子(Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+)、EDTA和SDS下的單寧酶活力。

1.3.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分析

分別配制底物濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的沒食子酸丙酯溶液,在最適條件下反應(yīng)5 min,測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處的吸光度,計(jì)算酶活力和反應(yīng)速率,利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km及Vmax值。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次,利用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酶afTanA基因Kex2位點(diǎn)分析

2013年,第一個(gè)植物乳桿菌來源的單寧酶晶體結(jié)構(gòu)才被解析(PDB:4JUI)[17]。單寧酶家族的AoFaeB晶體結(jié)構(gòu)(PDB:3WMT)[18]由一個(gè)具有典型的a/β絲氨酸水解酶結(jié)構(gòu)區(qū)域和蓋子結(jié)構(gòu)域所組成,雖然該酶屬于單寧酶家族中的阿魏酸脂酶,這使得該晶體結(jié)構(gòu)還無法完全提供充足真菌來源單寧酶的結(jié)構(gòu)信息,但是對(duì)真菌單寧酶的分子機(jī)制提供了一定的借鑒。經(jīng)對(duì)多個(gè)單寧酶序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),位于蓋子結(jié)構(gòu)區(qū)域中的LoopFK中的K315-R316位點(diǎn)氨基酸普遍存在單寧酶中(圖1)。不同來源的單寧酶在該區(qū)域中表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨異進(jìn)化,其中米曲霉單寧酶(ABJ51876.1)差異最大,除在該區(qū)域有2 個(gè)連續(xù)的Kex2酶切位點(diǎn)外,同時(shí)還有較長(zhǎng)的Loop結(jié)構(gòu),這表明AfTan中的Kex2位點(diǎn)對(duì)酶的影響很可能與之有明顯差異。

圖1 使用I-TASSER構(gòu)建的AfTanA分子模型（a）及Kex2位點(diǎn)（b）分析Fig. 1 Molecular model of AfTanA constructed using the I-TASSER server (a) and analysis of Kex2 sites (b)

2.2 Kex2位點(diǎn)突變體的構(gòu)建

采用一步式定點(diǎn)突變對(duì)afTan基因進(jìn)行突變,對(duì)測(cè)序結(jié)果分析,分別成功構(gòu)建突變pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR克隆載體。隨后,將突變基因分別連接至pPIC9K質(zhì)粒中,并成功轉(zhuǎn)入GS11中,經(jīng)過對(duì)陽性克隆子誘導(dǎo)表達(dá),各篩選出1 株高產(chǎn)菌株。

2.3 突變體的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

圖2 野生型AfTanA及其突變體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wild-type AfTanA and mutants

將重組菌株按1.3.5節(jié)方法進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)之后,對(duì)AfTanR316A和AfTanΔKR發(fā)酵液進(jìn)行酶活力測(cè)定,25 ℃培養(yǎng)2 d發(fā)酵液中單寧酶活力分別為793 U/mL和830 U/mL。

通過對(duì)比野生型AfTanA、突變體AfTanR316A和AfTanΔKR發(fā)酵液SDS-PAGE結(jié)果(圖2),發(fā)現(xiàn)野生型發(fā)酵產(chǎn)物在約45～60 kDa區(qū)域內(nèi)處出現(xiàn)蛋白條帶,明顯低于理論分子質(zhì)量(61.9 kDa);而突變體AfTanR316A和AfTanΔKR樣品全部在100 kDa出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶,分子質(zhì)量明顯偏大,這與野生型結(jié)果差異明顯。分別對(duì)上述3 種酶經(jīng)去糖基化酶Endo H處理,分子質(zhì)量均不同程度變小,并且從結(jié)果中能明顯發(fā)現(xiàn)野生型單寧酶是由2 個(gè)亞基組成(其分子質(zhì)量分別為31.7 kDa和30.4 kDa),而2 個(gè)突變體均未出現(xiàn)類似的現(xiàn)象,表明Kex2位點(diǎn)突變體對(duì)Kex2蛋白酶的抗性明顯增強(qiáng)。經(jīng)去糖基化處理后,兩突變體的分子質(zhì)量均為70 kDa左右,較理論值大10kDa左右。經(jīng)NetNGlyc 1.0分析,單寧酶AfTanA中具有8 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),經(jīng)NetOGlyc 4.0分析AfTanA中含有14 處O-糖基化位點(diǎn),表明單寧酶AfTanA的糖基化修飾使其分子質(zhì)量明顯增大。

2.4 突變體AfTanR316A和AfTanΔKR酶學(xué)特性分析

為探究Kex2酶切位點(diǎn)(K315-R316)對(duì)突變體酶學(xué)特性的影響,對(duì)2 個(gè)突變體的酶學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。

圖3 單寧酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)比較分析Fig. 3 Characterization of AfTanR316A and AfTanΔKR

由圖3A可知,突變體在0～70 ℃范圍內(nèi)均有活性,最適反應(yīng)溫度均為20 ℃,屬于低溫酶。在反應(yīng)溫度為0 ℃時(shí),突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的酶活力分別維持68%和63%以上,在60 ℃條件下,突變體AfTanR316A能夠維持10%左右酶活力,而突變體AfTanΔKR則表現(xiàn)出40%左右的酶活力。由圖3B可知,突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的pH值反應(yīng)范圍分別為2.0～8.0和2.0～9.0,最適反應(yīng)pH值均為5.0左右。整體而言,在pH 2.0～5.0區(qū)間內(nèi),突變體AfTanR316A較AfTanΔKR活性高,而在pH 5.0～9.0區(qū)間內(nèi)時(shí),突變體AfTanΔKR較AfTanR316A活性高。由圖3C可知,2 個(gè)突變體在pH值穩(wěn)定性方面存在差異。在pH 2.0～12.0分別處理1 h后,突變體AfTanR316A和AfTanΔKR分別能夠維持60%和85%以上酶活力。突變體AfTanR316A在pH 4～8區(qū)間內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,能夠達(dá)到85%以上酶活力,而在堿性范圍內(nèi),酶活力大幅度降低,在pH值12.0處理1 h后,AfTanR316A酶活力損失40%;由圖3D可知,2 個(gè)突變體在40 ℃處理時(shí),酶相對(duì)穩(wěn)定,基本沒有活性的損失。50 ℃處理?xiàng)l件,2 個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性能差異明顯,尤其當(dāng)處理10 min以內(nèi)時(shí),AfTanΔKR能夠維持90%以上活性,而AfTanR316A則維持70%左右活性,突變體AfTanΔKR表現(xiàn)出相對(duì)較高的穩(wěn)定性,這表明“KR”位點(diǎn)不僅可以影響AfTan對(duì)Kex2酶的敏感性,同樣對(duì)酶蛋白的熱穩(wěn)定性造成了影響,這很可能是“KR”所處的Loop結(jié)構(gòu)的改變所造成的。Loop結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的柔性,繼而會(huì)增加蛋白空間結(jié)構(gòu)的搖擺性,而Loop結(jié)構(gòu)中氨基酸的缺失,會(huì)使得Loop結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng),繼而提高酶的熱穩(wěn)定性。

2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

如表2所示,離子濃度對(duì)酶活力影響存在差異,且不同離子種類也存在較大差異?？傮w而言,兩種突變體普遍被金屬離子和化學(xué)試劑抑制,且高濃度條件(5 mmol/L)下抑制更加明顯,而突變體AfTanΔKR較AfTanR316A受金屬離子和化學(xué)試劑影響大。Fe3+對(duì)2 個(gè)突變體酶活力的抑制效應(yīng)最顯著,在高濃度下,對(duì)突變體AfTanR316A和AfTanΔKR能夠抑制76%和97%酶活力。在低濃度(1 mmol/L)的條件下,除Fe3+外,其他金屬離子和化學(xué)試劑均未對(duì)突變體AfTanR316A酶活力造成影響,而突變體AfTanΔKR均不同程度受到15%～80%抑制,Mg2+對(duì)酶活力影響最低。在高濃度(5 mmol/L)條件下,除Li+外,其他金屬離子和化學(xué)試劑均對(duì)兩突變體酶活力造成顯著影響。除Fe3+離子外,Mn2+和Zn2+對(duì)酶活力均能抑制50%左右。

表2 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)突變體相對(duì)酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the activities of mutants%

以沒食子酸甲酯為底物,經(jīng)動(dòng)力學(xué)曲線回歸方程計(jì)算,AfTanR316AKm為1.149 mmol/L,Vmax為10.427 mmol/(L·min);AfTanΔKRKm為1.46 mmol/L,Vmax為35.84 mmol/(L·min)。兩者的Km差異不明顯,但是Vmax改變較大,AfTanΔKR的催化提高了2 倍左右。結(jié)果表明,K315-R316位點(diǎn)不僅可以對(duì)酶的穩(wěn)定性有影響,對(duì)于酶的催化效率影響也較為顯著。

2.6 突變單寧酶在柿子汁中的應(yīng)用

柿子中富含單寧物質(zhì),經(jīng)水解可生成兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯等小分子的酚類化合物[19],這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的生物活性。本研究通過測(cè)定野生型單寧酶AfTanA和2 個(gè)突變體AfTanR316A和AfTanΔKR處理柿子后的多酚類物質(zhì)變化,探討在柿子汁加工中的應(yīng)用潛力,結(jié)果如圖4所示。

柿子汁中多酚經(jīng)單寧酶處理后差異變化較明顯,2 種突變體表現(xiàn)出與野生型單寧酶相似的催化效果。多酚含量平均提高約50%(約43 mg/L),這是由于大分子多酚物質(zhì)(單寧)降解為小分子的酚類化合物所致,從而顯著增強(qiáng)柿子汁多酚含量,突變體酶同野生單寧酶一樣可應(yīng)用在柿子果汁的加工中。

圖4 柿子汁水解前后多酚類物質(zhì)含量分析Fig. 4 Total phenolic concentration of persimmon juice before and after hydrolysis with wild-type AfTanA and mutants, separately

3 討 論

目前,巴斯德畢赤酵母GS115表達(dá)系統(tǒng)能夠使外源蛋白被正確修飾,己成功對(duì)上百種外源基因進(jìn)行了表達(dá),是最成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。隨著研究不斷深入發(fā)現(xiàn),單寧酶是由2 個(gè)或2 個(gè)以上亞基單位(30 kDa和34 kDa)連接組成一個(gè)蛋白分子質(zhì)量范圍為50～320 kDa的多聚體。其中,造成這2 個(gè)亞單位產(chǎn)生的原因是由于Kex2蛋白酶的切割[20]。Kex2蛋白酶是畢赤酵母內(nèi)源性蛋白酶,主要在蛋白合成加工過程中發(fā)揮作用[21],而該酶對(duì)外源蛋白的過度切割,必然會(huì)影響到蛋白的穩(wěn)定性和活性,因此探索單寧酶中的Kex2位點(diǎn)對(duì)酶學(xué)特性的影響意義重大。

經(jīng)分析,兩種突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的電泳條帶都顯現(xiàn)為單一的電泳條帶,表明AfTanA中Kex2位點(diǎn)(K315-R316)的替換和缺失都使得酶對(duì)Kex2蛋白酶抗性明顯增強(qiáng),而這與Koseki等[15]發(fā)現(xiàn)Kex2位點(diǎn)氨基酸的精氨酸替換并不能增強(qiáng)單寧酶AoTanA對(duì)Kex2蛋白酶的抗性結(jié)論不一致。通過對(duì)這2 個(gè)單寧酶結(jié)構(gòu)分析,兩者的氨基酸一致性只有21%,這使得空間結(jié)構(gòu)上存在差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)單寧酶AoTanA中存在2 個(gè)Kex2位點(diǎn)(Lys310-Arg311,Lys315-Arg316),而單寧酶AfTanA僅存在1 個(gè)Kex2位點(diǎn)(Lys315-Arg316)。雖然它們?nèi)刻幵贚oopFK區(qū)域中,但是單寧酶AoTanA較單寧酶AfTanA長(zhǎng)7 個(gè)氨基酸,這使得單寧酶AoTanA中的該區(qū)域暴露在蛋白的表面較多,更容易被Kex2蛋白酶所識(shí)別切割。突變菌株的發(fā)酵液中單寧酶活力較野生AfTanA提高了12%和22%左右,進(jìn)一步說明Kex2位點(diǎn)的改造有利于單寧酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

本課題組前期己對(duì)AfTanA進(jìn)行了異源表達(dá)和性質(zhì)測(cè)定,通過對(duì)比AfTanA、AfTanR316A和AfTanΔKR的酶性質(zhì)發(fā)現(xiàn),突變體和野生型單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)差異明顯。如單寧酶AfTanA的最適反應(yīng)溫度為40 ℃,而兩種突變體最適反應(yīng)溫度均為20 ℃,由常溫酶轉(zhuǎn)變?yōu)榈蜏孛竅22]。大部分己報(bào)道的單寧酶最適反應(yīng)溫度范圍為30～60 ℃,最適pH值為5.0～6.0,單寧酶活力能夠穩(wěn)定的pH值范圍為3.0～8.0[23-24]。Fuentes等[25]從黑曲霉GH1中首次獲得了嗜冷單寧酶,而隨后鮮有低溫單寧酶的報(bào)道。本研究分析造成反應(yīng)溫度發(fā)生改變的原因,很可能是由于野生型單寧酶AfTanA中2 個(gè)亞基(Kex2蛋白酶切割產(chǎn)物)通過C202-C502間的二硫鍵連接,而突變后的兩蛋白片段是由高鍵能的肽鍵所連接,同時(shí)精氨酸的缺失使得結(jié)構(gòu)中的次級(jí)鍵數(shù)目大大減少,繼而該區(qū)域柔性增強(qiáng),更有利于酶適應(yīng)低溫的反應(yīng)條件[26]。因此,K315-R316位點(diǎn)可以作為溫度突變體相關(guān)研究的選擇位點(diǎn)。參考己報(bào)道單寧酶的晶體結(jié)構(gòu)可知,單寧酶AftanA可以分為“Lid”和“Catalytic”2 個(gè)模塊,并且具有保守的“CS-D-HC”序列,相似的結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在脂肪酶中[27]。本研究單寧酶AfTanA中的Kex2位點(diǎn)(K315-R316)位于“Lid”模塊LoopFK區(qū)域中,該區(qū)域與酶的催化效率和穩(wěn)定性有較大相關(guān)性。Xiao Xunjun等[28]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶中的“Lid”模塊雖然不是酶的催化區(qū)域,但是在底物的接合和產(chǎn)物的釋放過程中發(fā)揮著重要作用。Johnson等[29]在探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶中的“Lid”模塊中的Loop結(jié)構(gòu)功能時(shí),同樣發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與酶的催化效率有很大相關(guān)性。因此,Kex2酶切位點(diǎn)(K315-R316)對(duì)AftanA酶學(xué)性質(zhì)的影響,很可能該位點(diǎn)所處的Loop區(qū)域結(jié)構(gòu)的特性所造成的[30],而內(nèi)在的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探明。

經(jīng)對(duì)突變體和野生型單寧酶在柿子汁的應(yīng)用對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),Kex2位點(diǎn)(K315-R316)的單點(diǎn)替換突變AfTanR316A和雙點(diǎn)缺失突變AfTanΔKR對(duì)柿子中多酚物質(zhì)(單寧)的降解能力并未發(fā)生改變,具有野生型單寧酶相同的應(yīng)用效果。

本研究通過對(duì)單寧酶AfTanA中Kex2蛋白酶位點(diǎn)(K315-R316)對(duì)酶性質(zhì)的影響分析,明確該位點(diǎn)對(duì)于酶的催化效率和穩(wěn)定性影響較大,雙點(diǎn)的缺失突變AfTanΔKR單寧酶表現(xiàn)出更加優(yōu)良的酶學(xué)特性,具有在食品工業(yè)中發(fā)揮巨大作用的潛力。