韓立柱，李 寧，胡坤霞，汪蕓蘭，段璽，唐志書，宋 逍*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatic arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的急性或慢性的結(jié)締組織炎癥，是由鏈球菌感染導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)疼痛的部位主要以膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)等大關(guān)節(jié)為主，同時(shí)伴有皮膚的皮疹及發(fā)熱等癥狀[1]。

川烏是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的干燥母根，用于治療各種風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀。其主要成分烏頭堿具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。草烏是毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根，烏頭類生物堿為主要的抗炎成分，對(duì)風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎等病癥有良好的治愈效果。馬錢子(Strychnosnux-vomicaL.)用于治療各種風(fēng)濕頑痹、骨折腫痛等癥狀，主要成分馬錢子堿具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種藥理作用。天南星(Arisaemaerubescens(Wall.)Schott)中所含的有效成分三萜皂苷類具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛功效。鐵棒錘是烏頭屬鐵棒錘或伏毛鐵棒錘的塊根，具有活血祛瘀、祛風(fēng)濕、止痛的功效，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛等病癥。有效成分烏頭堿具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、局麻作用[2-5]?？搽x砂為黑色的粗粉，由當(dāng)歸、川芎、防風(fēng)、透骨草的粗粉以及適量鐵粉、木粉、活性炭和氯化鈉組成，用于治療各種風(fēng)寒濕痹、四肢麻木、關(guān)節(jié)疼痛等病癥[6]。在此方中主要作為輔助發(fā)熱的部分，促進(jìn)藥效吸收。

此方是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成方湯劑，將其制備為透皮貼劑，并將坎離砂制成小包裝作為背襯層，起到輔助發(fā)熱的作用，以便更好地促進(jìn)藥效吸收。貼劑主要是由藥物貯庫(kù)、背襯層及防黏層組成；藥物通過(guò)皮膚吸收產(chǎn)生全身作用或局部作用的片狀制劑稱為透皮制劑。其有效成分經(jīng)皮膚吸收達(dá)到治療效果，無(wú)肝臟的首過(guò)效應(yīng)，且藥物的利用度高，吸收速率穩(wěn)定。具有療效迅速、血藥濃度穩(wěn)定、作用時(shí)間長(zhǎng)、給藥次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；恒溫水浴鍋(北京科偉永業(yè)儀器有限公司)；BSA224S型萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯北京科學(xué)儀器)；電子天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械十廠)；98-1-B型電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；BLD-200N型電子剝離試驗(yàn)機(jī)(濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司)；CZY-G)型黏性測(cè)試儀(南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司)；Vortex-Genie漩渦混合器(北京卓信宏業(yè)儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

馬錢子、川烏、草烏、生南星、鐵棒錘(市售)；坎離砂(天津康樂(lè)產(chǎn)業(yè)有限公司)；烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)：PS000905、純度>98.0%)購(gòu)于成都普思生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、甘油、1，2-丙二醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；三乙胺(天津福辰試劑有限公司)；水溶性氮酮(芮城縣壹善中間體有限公司)；壓敏膠(杭州漢特化工有限公司；高、中、低黏度)；生理鹽水(辰欣藥業(yè))。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方提取物的制備

稱取適量馬錢子、川烏、草烏、生南星、鐵棒錘。將藥材用8倍量的65%乙醇回流提取3次，每次2 h。將所得提取液揮發(fā)至無(wú)醇味，濃縮至稠膏狀將其置于烘箱中烘干，得干燥粉末狀提取物。

2.2 透皮貼劑制備

稱取一定量的提取物，用適量的溶劑溶解(超聲40 min，混勻20 min)，加入聚丙烯酸酯類壓敏膠和促滲劑，攪拌均勻，超聲15 min去除氣泡，均勻涂布在防粘紙上，靜置于50 ℃烘箱中揮干溶劑，冷卻后壓覆小包裝的坎離砂，即得。

2.3 溶劑種類選擇

稱取0.25 g提取物并加入2 mL溶劑，將提取物的溶解度及藥液的細(xì)膩程度作為指標(biāo)，觀察提取物在不同溶劑中的溶解效果以及有效成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果知30%乙醇可以將提取物溶解，但是溶解不完全；提高乙醇的濃度后，提取物全部溶解，但是高濃度的乙醇容易揮發(fā)，導(dǎo)致溶解后的液體變的比較黏稠，并且還有少量提取物沒(méi)有被溶解。甘油和1，2-丙二醇都能完全將提取物溶解，但是1，2-丙二醇須和氮酮合用才能增加促滲作用；因此選擇1，2-丙二醇為最佳溶劑。

表1 溶劑種類對(duì)提取物的影響

2.4 溶劑用量選擇

制備載藥量為10%的透皮貼劑；通過(guò)提取物的溶解度，藥物溶液與壓敏膠的混合性，以及貼劑的成型性來(lái)確定溶劑的用量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)1，2-丙二醇的用量太小時(shí)，藥液容易變黏稠，并且在壓敏膠中分散不均勻，當(dāng)1，2-丙二醇的用量太大時(shí)，會(huì)使壓敏膠的黏性降低，并且導(dǎo)致透皮貼劑的載藥量降低，同時(shí)背襯層會(huì)有溶劑滲出，導(dǎo)致患者在使用時(shí)皮膚上會(huì)出現(xiàn)溶劑殘留。以提取物∶溶劑用量=1∶2的比例最為適宜。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溶劑用量對(duì)提取物的影響

2.5 壓敏膠黏度選擇

選擇高、中、低三種不同黏度的壓敏膠，制備載藥量為10%的透皮貼劑，比較膠液外觀、涂展性及黏附性，并選擇合適的壓敏膠。固定載藥量為10%，每種型號(hào)的壓敏膠各做三組平行的透皮貼劑，進(jìn)行黏附力測(cè)定[9-10]，分別求取平均值，得高、中、低三種黏度的壓敏膠中，中黏度的壓敏膠內(nèi)聚力最好。結(jié)果見(jiàn)表3，由結(jié)果可知，中黏度的壓敏膠涂展性較好。

表3 不同黏度壓敏膠對(duì)透皮貼劑的影響

2.6 載藥量的篩選

制備不同載藥量的透皮貼劑，從透皮貼劑的外觀形態(tài)及粘力大小來(lái)選擇合適的載藥量，以方便患者的使用。貼劑的載藥量較小時(shí)，透皮貼劑的外觀較均勻，并且容易涂布，但初粘力較大。貼劑的載藥量過(guò)大時(shí)，透皮貼劑的外觀不均勻，并且涂布困難，綜合考慮透皮貼劑的外觀及粘力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)透皮貼劑的載藥量為10%時(shí)，貼劑的外觀及粘力最適宜。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同載藥量對(duì)透皮貼劑的影響

2.7 坎離砂的用量的篩選

由以上單因素實(shí)驗(yàn)確定了貼劑基質(zhì)、溶劑用量、載藥量的貼劑，改變坎離砂的用量來(lái)確定貼劑的發(fā)熱溫度和持續(xù)發(fā)熱時(shí)間。坎離砂作為成方制劑，其每劑規(guī)格為62.5 g，達(dá)到40 ℃的時(shí)間平均為80 min，40 ℃以上發(fā)熱時(shí)間為5.2 h，最高溫度可達(dá)75 ℃以上，會(huì)對(duì)人體造成局部燙傷[11-12]。在此方中作為輔助放熱的部分，在坎離砂原方用量減少一半，以及原方用量的1/3，對(duì)其發(fā)熱溫度、持續(xù)發(fā)熱時(shí)間以及最高溫度作為考察指標(biāo)，確定最終用量。綜合考慮，確定減少一半劑量制成小包裝作為貼劑的背襯層。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同用量坎離砂對(duì)貼劑的影響

2.8 促透劑選擇

本實(shí)驗(yàn)選用氮酮來(lái)作為促滲劑，氮酮為一種非離子型表面活性劑，無(wú)毒無(wú)刺激，效能高，對(duì)多數(shù)疏水或親水物質(zhì)的透皮吸收均有較好的促滲作用，因而更適用于成分復(fù)雜的中藥經(jīng)皮制劑[13]。丙二醇在單獨(dú)使用時(shí)，促滲作用不佳，而與氮酮合用可提高其促滲效果，故本實(shí)驗(yàn)選擇氮酮作為促滲劑。

3 有效成分烏頭堿及黏附性能測(cè)定

3.1 色譜條件

采用ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.3%∶三乙胺(65∶35)；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[14]。

3.2 HPLC法測(cè)定烏頭堿的含量

3.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取烏頭堿5 mg，置于5 mL的棕色容量瓶中，再加甲醇溶解并稀釋至刻度。

3.2.2 供試品溶液制備 精密稱取提取物0.25 g，制備載藥量為10%的貼劑，溶劑揮干后將其從防黏層上完整取下，并用5 mL甲醇溶解，再取其上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

3.2.3 陰性溶液制備 不加提取物，制備載藥量為10%的透皮貼劑，溶劑揮干后將其從防粘層上完整取下，并用5 mL甲醇溶解，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得陰性溶液。

3.3 專屬性考察

對(duì)照品、供試品、陰性溶液的HPLC色譜見(jiàn)圖1，可知空白貼劑及溶劑對(duì)烏頭堿的含量測(cè)定沒(méi)有干擾。

A：對(duì)照品；B：供試品；C：陰性對(duì)照

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液適量，并逐步稀釋成1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.062 5 mg/mL、0.031 25 mg/mL的一系列濃度溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=174.39X+5.614 6(Y為峰面積，X為進(jìn)樣濃度)，R2=0.998 3，在0.031 25～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.4.1”項(xiàng)下濃度為0.25 mg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀連續(xù)測(cè)定6次，RSD值為3.683%，表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取“3.4.1”項(xiàng)下濃度為0.25 mg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀連續(xù)測(cè)定6次，RSD值為2.333%。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫條件下，精密吸取“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h分別注入液相色譜儀測(cè)定，RSD值為1.384%，表明供試品穩(wěn)定性良好。

3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取“3.4.1”項(xiàng)下濃度為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL對(duì)照品溶液各1 mL，并將其分別加入等量的陰性溶液中，制成低、中、高質(zhì)量濃度溶液，在“3.1”色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，烏頭堿的回收率為98.24%，RSD值為2.782%。

3.5 優(yōu)化工藝和驗(yàn)證試驗(yàn)

優(yōu)化后的制備工藝為：透皮貼劑的基質(zhì)是中黏度的壓敏膠，溶解提取物的溶劑為1，2-丙二醇，溶劑的用量以1∶2(提取物∶溶劑)最優(yōu)，透皮貼劑的載藥量為10%。工藝流程為：稱取適量提取物，加入提取物2倍量的1，2-丙二醇充分溶解提取物(超聲40 min，混勻20 min)后，加入中黏度的壓敏膠和一定量的促滲劑，混勻后，超聲脫氣，將其均勻涂布于防黏紙上，靜置于40 ℃烘箱中揮干溶劑，低溫固化，冷卻后壓覆帶有坎離砂的背襯材料，即得。應(yīng)用優(yōu)化后的制備工藝制作3批試樣，其初黏力均在13號(hào)小球左右，持黏力平均在20 min，制得的貼劑具有良好的初黏力和持黏力。

4 討論

透皮貼劑主要是通過(guò)擴(kuò)散作用而達(dá)到治療效果，藥物的有效成分從貼劑的貯庫(kù)中擴(kuò)散出來(lái)直接進(jìn)入皮膚和血液循環(huán)，透皮貼劑的藥效由藥物含量及釋藥速率所決定?？搽x砂由于本身就具有治療風(fēng)濕寒痹、關(guān)節(jié)疼痛等功效，在本方中作為輔助發(fā)熱的部分來(lái)促進(jìn)藥物的吸收?？搽x砂原本用量最高溫度可達(dá)75 ℃以上，會(huì)對(duì)人體造成局部燙傷，減小劑量后，發(fā)熱溫度始終在75 ℃以下，對(duì)人體來(lái)說(shuō)相對(duì)安全[15-16]。考慮到坎離砂的持續(xù)發(fā)熱時(shí)間以及貼劑的釋藥面積，最終選擇減少一半劑量，將坎離砂制作成小劑量的包裝，并作為貼劑的背襯層。該貼劑最重要的一點(diǎn)是有坎離砂作為輔助發(fā)熱部分，能更好地促進(jìn)藥物吸收。

骨架型透皮貼劑是將藥物與促透劑均勻分散在壓敏膠材料中形成壓敏膠骨架，然后均勻地涂布在防粘層上，壓覆背襯層即得；其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，且藥物透過(guò)率高，適合患者使用[17]。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)制備得處方透皮貼劑，考察了溶劑種類、載藥量、促透劑和砍離沙用量等因素，透皮貼劑進(jìn)行了體外有效成分烏頭堿的測(cè)定具有一定的局限性，還需要進(jìn)行在體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)及毒性實(shí)驗(yàn)，考察其在體皮膚吸收情況，充分保證貼劑的安全性和有效性。經(jīng)過(guò)高效液相測(cè)定和黏附力測(cè)試表明其具有良好的載藥量和黏附性能，該制備工藝穩(wěn)定可行，可用于風(fēng)濕骨痛貼的制備，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。