孫興華，張 淼，武文鵬，李書霖

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是癡呆最常見的一種形式，又稱為老年性癡呆（senile dementia）[1-2]，常隱襲起病，主要表現(xiàn)為持續(xù)進(jìn)行性的智能衰退無(wú)緩解，早期以近期記憶力受損為主，中期以視空間技能損害、定向力障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)以及人格改變?yōu)橹?，晚期可出現(xiàn)判斷力、認(rèn)知力的完全喪失[3-4]。AD已成為嚴(yán)重威脅人們健康的主要疾病之一[5-6]，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域尚未解決的難題。中醫(yī)藥治療AD在理論和臨床上都積累了豐富經(jīng)驗(yàn)[7-9]，如《醫(yī)林改錯(cuò)·腦髓篇》載：“高年無(wú)記性者，腦髓漸空?！薄妒颐劁洝吩弧爸未魺o(wú)奇法，治痰即治呆也?！焙邶埥嗅t(yī)藥大學(xué)高維濱教授基于“督脈貫脊屬腎入絡(luò)腦”的認(rèn)識(shí)，臨證診療時(shí)常通過(guò)調(diào)整督脈而疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、充髓益智、醒腦調(diào)神。高維濱教授的督脈理論針灸學(xué)術(shù)思想被應(yīng)用于臨床[10]。課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，調(diào)督針刺能夠改善AD患者的認(rèn)知功能，延緩病情進(jìn)展，提高患者的生存質(zhì)量。但有關(guān)針刺治療AD作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。已有研究表明，炎性反應(yīng)參與AD的病理過(guò)程，其發(fā)生與β-淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）淀粉樣斑塊沉積與長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)造成腦損傷相關(guān)，Aβ過(guò)度激活周圍的星形膠質(zhì)，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、補(bǔ)體等多種炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，使神經(jīng)元損傷而影響認(rèn)知功能[11-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42制備AD大鼠模型，觀察調(diào)督針刺對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用以及對(duì)海馬病理組織形態(tài)學(xué)、IL-6、TNF-α、GFAP的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠48只，雄性，2～3月齡，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（黑）2016004。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物所進(jìn)行的操作嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 儀器及試劑 大鼠腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）；Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；LKB-V型超薄切片機(jī)（瑞士BROMMA公司）；Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Motic）；淀粉樣β蛋白片段1-42（Sigma公司）；抗IL-6多克隆抗體、抗TNF-α多克隆抗體、抗GFAP多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司；S-P試劑盒、DAB顯色液（北京中杉金橋生物有限公司）；蘇木素液、醋酸雙氧鈾、俄酸、伊紅染色液、戊二醛由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)前分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的后2 d進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，每天2次。經(jīng)過(guò)訓(xùn)練，將反應(yīng)特別敏感或過(guò)于遲鈍的大鼠剔除，保留48只大鼠用于實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組12只。

1.4 模型制備 參照文獻(xiàn) [13-14]所述的方法制備AD模型，采用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，將大鼠固定腦立體定位儀上，剪去頭頂部鼠毛，常規(guī)消毒，切開皮膚，選取雙側(cè)海馬區(qū)作為注射Aβ1-42靶區(qū)，于前囟向后3.0 mm，中線分別向左右旁開1.5 mm，將顱骨鉆開，暴露硬腦膜，采用氧化氫法剔除硬腦膜，鉆孔后采用微量進(jìn)樣器將Aβ1-425 μL均勻緩慢注入，5 min后撤針，以確保Aβ1-42溶液擴(kuò)散完全。撤針后，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)，予以青霉素腹腔注射預(yù)防術(shù)后感染。

1.5 各組處理方法 空白組：正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。假手術(shù)組：顱內(nèi)注射等量生理鹽水（5 μL），其他處理同模型組。模型組：造模成功后第8天開始，給予同等針刺組相同抓取、固定。針刺組：造模成功后第8天開始，參照“大鼠穴位圖譜”[15]取大鼠“百會(huì)”“風(fēng)府”。用0.35 mm×15 mm不銹鋼毫針針刺“百會(huì)”（以15°角向前平刺 2 mm）、“風(fēng)府”（直刺 2 mm），補(bǔ)瀉手法采用平補(bǔ)平瀉，捻轉(zhuǎn)1 min，接通脈沖針灸治療儀（KWD-808I型），疏波（頻率為2 Hz），強(qiáng)度以大鼠局部輕顫為度，留針30 min，每天1次，連續(xù)治療28 d。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 行為學(xué)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力 采用Morris水迷宮法。本實(shí)驗(yàn)造模前連續(xù)訓(xùn)練4次，治療第23天后開始連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練4次。將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從水中到找到平臺(tái)所需的時(shí)間（即潛伏期）。造模前和治療后定位航行，試驗(yàn)結(jié)束后第2天進(jìn)行空間搜索試驗(yàn)。去除平臺(tái)，記錄在60 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)游泳距離。

1.6.2 光鏡技術(shù)檢測(cè)海馬組織病理形態(tài)學(xué) 大鼠10%水合氯醛麻醉，50 mL生理鹽水灌注左心室，待肝臟變白后，4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦組織，在冰盒上迅速剝離海馬組織。海馬組織固定，常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-6、TNF-α、GFAP的表達(dá) 取上述石蠟包埋的各組大鼠腦組織，常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)抗原后，按照北京中杉金橋生物有限公司提供的免疫組化試劑盒操作步驟說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)具體操作。采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以細(xì)胞質(zhì)染為黃色或黃棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張片中選取5個(gè)染色較好的視野拍照，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞染色的積分光密度（以IOD值表示），IOD=陽(yáng)性面積×平均光密度，取5個(gè)高倍視野的均值代表該樣本陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量。每組分析4例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示；組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 本實(shí)驗(yàn)造模后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神欠佳、食量減少、行動(dòng)減緩、反應(yīng)遲鈍，體重增長(zhǎng)緩慢。針刺組大鼠造模后1周內(nèi)的一般情況表現(xiàn)同模型組，但隨著針刺治療時(shí)間的推移而出現(xiàn)精神狀態(tài)改善、進(jìn)食增加、活動(dòng)增多的表現(xiàn)。

2.2 各組大鼠治療前后的體質(zhì)量變化 造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠治療前后的體質(zhì)量變化（±s，n=12，g）

表1 各組大鼠治療前后的體質(zhì)量變化（±s，n=12，g）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 造模前 治療后空白組 2 6 4.2 0±1 8.4 7 3 8 4.7 0±3 2.6 1假手術(shù)組 2 6 1.5 0±2 1.2 2 3 7 7.9 0±3 4.8 5模型組 2 6 2.7 0±1 9.6 4 3 2 5.5 0±3 1.2 3*針刺組 2 6 6.4 0±2 0.8 3 3 5 8.2 0±2 6.4 4#

2.3 針刺對(duì)AD大鼠潛伏期和游泳距離的影響與空白組比較，假手術(shù)組潛伏期和游泳距離均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），游泳距離明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠潛伏期明顯縮短（P<0.05），游泳距離明顯縮短（P<0.05），見表 2。

表2 針刺對(duì)AD大鼠潛伏期和游泳距離的影響（±s，n=12）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 潛伏期/s 游泳距離/c m空白組 1 6.9 3±3.5 1 5 7 4.3 6±6 2.4 3假手術(shù)組 1 8.5 6±4.3 0 5 9 0.7 5±7 4.5 7模型組 4 2.7 2±7.4 6* 1 2 0 9.2 6±1 0 7.6 2*針刺組 3 1.4 5±5.2 3# 8 7 6.5 2±8 5.1 6#

2.4 針刺對(duì)AD大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)的影響HE染色可看出，空白組神經(jīng)元分布均勻，形態(tài)規(guī)整，核仁清晰。假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)尚規(guī)整，核仁清晰，散見少量炎性細(xì)胞和凋亡小體。模型組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)較少，核仁不清晰，神經(jīng)元萎縮，毛細(xì)血管腫脹。與模型組相比，針刺組神經(jīng)細(xì)胞排列較為規(guī)則，神經(jīng)元萎縮較少，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理圖（HE染色，×400）

2.5 針刺對(duì)AD大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果示，IL-6、TNF-α、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，各組海馬組織均有IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)。模型組表達(dá)強(qiáng)，表達(dá)細(xì)胞多；空白組和假手術(shù)組表達(dá)弱，表達(dá)細(xì)胞少；針刺組表達(dá)介于模型組和空白組/假手術(shù)組之間。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α、GFAP的表達(dá)顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠IL-6、TNF-α、GFAP的表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。結(jié)果見圖 2、表 3。

圖2 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP免疫組化結(jié)果（×400）

表3 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)比較（±s，n=4）

表3 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)比較（±s，n=4）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 I L-6 T N F-α G F A P空白組 0.1 8 9±0.0 3 2 0.2 3 5±0.0 2 8 0.2 7 0±0.0 4 1假手術(shù)組 0.2 1 0±0.0 2 6 0.2 5 4±0.0 3 7 0.3 1 1±0.0 3 4模型組 0.7 8 4±0.0 5 3* 0.9 7 2±0.0 8 9* 0.8 6 5±0.0 9 5*針刺組 0.5 2 1±0.0 3 8# 0.7 6 3±0.0 6 2# 0.5 9 4±0.0 5 6#

3 討論

阿爾茨海默病是癡呆最常見的原因，其發(fā)病率呈隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增加的趨勢(shì)[16]，嚴(yán)重影響老年人社交與生活，給患者及家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和老年衛(wèi)生保健帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[17]。如何逆轉(zhuǎn)或阻止AD的病情進(jìn)展是世界性的難題。因此，探索AD的致病原因及形成機(jī)制，以及探討AD的消除策略和手段對(duì)于防治AD、提高人們生存質(zhì)量具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值，也是腦科學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究的重要前沿。

構(gòu)建一個(gè)好的AD動(dòng)物模型，使其更貼切于人類AD發(fā)病機(jī)制是實(shí)驗(yàn)成功的保障。目前用于構(gòu)建AD的動(dòng)物模型有多種方式，如根據(jù)微量元素學(xué)說(shuō)建立的阿爾茨海默病模型，以膽堿能損傷學(xué)說(shuō)建立的阿爾茨海默病模型，以衰老學(xué)說(shuō)建立的阿爾茨海默病模型，以Aβ為基礎(chǔ)建立的阿爾茨海默病模型，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的阿爾茨海默病模型等[18]，不同的制備方法各有側(cè)重。目前，認(rèn)為Aβ沉積是阿爾茨海默病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，大腦海馬區(qū)是內(nèi)側(cè)顳葉系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶最為密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。因此，海馬區(qū)是研究AD的理想靶區(qū)。本次研究即采用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42制備AD大鼠模型，從行為學(xué)結(jié)果看，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠潛伏期和游泳距離顯著增加，說(shuō)明模型組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力減退，證明所構(gòu)建的模型是成功的，可以用于后續(xù)研究。

學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)功能，學(xué)習(xí)是記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，記憶障礙及/或理解、分析、判斷等學(xué)習(xí)能力的障礙，是AD的早發(fā)癥狀之一。學(xué)習(xí)記憶水平是AD的診斷和療效評(píng)價(jià)指標(biāo)中最重要的因素。改善AD患者的記憶能力一直是神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。對(duì)學(xué)習(xí)記憶的評(píng)價(jià)是AD動(dòng)物模型的必要檢測(cè)指標(biāo)之一。Morris水迷宮已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中，得到了學(xué)者們的廣泛認(rèn)可。因此，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)價(jià)AD動(dòng)物模型的行為學(xué)是恰當(dāng)?shù)?。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，針刺組大鼠潛伏期和游泳距離均顯著縮短，說(shuō)明針刺能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

AD病因及機(jī)制迄今尚未完全闡明[19]。學(xué)者們認(rèn)為可能與遺傳學(xué)、免疫功能紊亂、炎癥學(xué)說(shuō)、神經(jīng)遞質(zhì)障礙、細(xì)胞骨架改變等有關(guān)[20-21]。阿爾茨海默病的主要病理特征是老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元大量丟失。而老年斑的核心成分為Aβ，Aβ大量沉積可引起炎癥反應(yīng)[22-24]。AD的炎癥假說(shuō)越來(lái)越引起重視。研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)炎癥及外周炎癥反應(yīng)均參與AD的病理過(guò)程。炎癥反應(yīng)既可能是AD病理的一個(gè)結(jié)果，又會(huì)進(jìn)一步加劇AD中的Aβ沉積。有證據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是AD患者腦中的顯著病理特點(diǎn)[25]。AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生包括 IL-1、IL-6、TNF-α、NO、GFAP 在內(nèi)的多種致炎因子，這些致炎因子的過(guò)度表達(dá)能夠損害神經(jīng)元，同時(shí)還能夠刺激膠質(zhì)增生反應(yīng)，使神經(jīng)元的退行性變進(jìn)一步加劇。因此，IL-6、TNF-α、GFAP炎性因子水平升高在AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。本次研究觀察針刺治療前后AD大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，針刺組IL-6、TNF-α、GFAP表達(dá)明顯降低，提示針刺具有調(diào)節(jié)AD大鼠炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，本次研究證實(shí)調(diào)督針刺具有改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。