沈嘉艷，楊 琦，劉 念，張艷坤，彭江云

（1.云南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，云南 昆明 650500；3.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021）

痛風性腎病（gouty nephropathy，GN）亦稱尿酸性腎病，是原發(fā)性痛風或高尿酸血癥患者病情遷延發(fā)展，累及腎臟導致腎臟損傷的一種疾病，若未進行及時有效救治，最終可發(fā)展為慢性腎功能衰竭[1]?，F(xiàn)階段西醫(yī)對GN的治療是以控制血尿酸（serum uric acid，SUA）水平，保護腎功能為主。盡管當前可供選擇的降SUA藥物種類繁多，但這些藥物對患者腎功能的影響卻不盡相同，部分藥物在具備良好的降SUA作用之時亦存在加重腎功能損害的風險[2]。近年來中醫(yī)藥治療GN的優(yōu)勢越來越凸顯，受到了眾多醫(yī)家的關注與重視，為本病的有效防治提供了更多的可能性。益腎健脾泄?jié)釡珵榕斫平淌谂R床常用處方，用于GN患者的治療每取驗效，全方由黨參、熟地、生薏苡仁、女貞子、墨旱蓮、三七、白術(shù)、貓須草、車前草等10余味藥組成，具有益腎健脾、泄?jié)峄龅墓πА１緦嶒灁M觀察益腎健脾泄?jié)釡珜N模型大鼠腎功能及腎臟病理改變的影響，探討益腎健脾泄?jié)釡珜N腎臟損傷的保護作用，為臨床應用益腎健脾泄?jié)釡委烥N提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級別Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自昆明楚商科技有限公司，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.2 藥物與試劑 益腎健脾泄?jié)釡幉模ㄋ酗嬈徲谠颇鲜≈嗅t(yī)醫(yī)院中藥房），非布司他片（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司，國藥準字H20130058），酵母提取粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3208095），腺嘌呤（上海源葉生物科技有限公司，批號：S09S10D97125），尿酸試劑盒、肌酐試劑盒和尿素氮試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（貨號分別為：C012-2、C011-2-1、C013-2-1）

1.3 儀器 MS104S/PL600-S電子分析天平產(chǎn)自瑞士 METTLER TOLEDO，Megafugel1.0R離心機產(chǎn)自德國Thermo Scientific Heraeus，N-110D-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀產(chǎn)自東京理化器械廠，恒溫培養(yǎng)箱產(chǎn)自上海躍進醫(yī)療器械有限公司，SpectraMax多功能酶標儀產(chǎn)自美谷分子儀器（上海）有限公司，DM2500正置顯微鏡和RM2235石蠟切片機，EG1150H+EG1130C生物組織包埋機HI1210烘片機、ASP300S全自動組織脫水機均產(chǎn)自德國萊卡儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 高酵母飼料的制備 按照酵母提取粉：普通大鼠飼料粉=1：9的比例充分混合攪拌均勻（酵母提取粉含量控制為10%），加工制成顆粒狀混合飼料。

1.4.2 中藥浸膏的制作 取中藥飲片加冷水浸泡30 min后煎煮40 min，共3次，混合藥液過濾3次，于離心機內(nèi)離心10 min后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成浸膏。控制每克浸膏等于4.8 g中藥原生藥量（此濃度符合浸膏劑的制作規(guī)范[3]）。

1.4.3 實驗分組及GN模型建立 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后將其分為空白組、模型組、陽性對照組（非布司他片組）和益腎健脾泄?jié)釡摺⒅?、低劑量組，每組各10只；除空白組外其余5組均以高酵母飼料喂養(yǎng)，控制酵母進食量為每只10 g/kg/d，并以腺嘌呤100 mg/kg/d灌胃，每日1次?？瞻捉M飼以普通大鼠飼料，并予灌胃同體積生理鹽水。連續(xù)21 d后眼眶靜脈叢取血測SUA、SCr、BUN均較空白組升高，造模成功。

1.4.4 實驗給藥 益腎健脾泄?jié)釡縿┰帪?16 g（含三七粉6 g兌服），臨床用法為：水煎服，2 d/劑，2次/d；非布司他片臨床用法為：口服，40 mg/d。按人與大鼠的體表面積比率換算等效劑量法計算大鼠非布司他片等效劑量為：3.6 mg/kg/d；大鼠浸膏等效劑量為2.93 g/kg/d，三七粉等效劑量為0.27 g/kg/d，將此等效劑量作為益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M大鼠的給藥量。各組大鼠分別于每日10時、17時進行灌胃：陽性對照組予非布司他片3.6 mg/kg/d；益腎健脾泄?jié)釡?、中、低劑量劑量組分別按照中藥浸膏5.86 g/kg/d+三七粉0.54 g/kg/d、中藥浸膏2.93 g/kg/d+三七粉0.27 g/kg/d、中藥浸膏1.47 g/kg/d+三七粉0.14 g/kg/d進行灌胃，空白組和模型組大鼠均以同體積生理鹽水灌胃；同時，空白組繼續(xù)飼以普通大鼠顆粒飼料，其余5組均繼續(xù)飼以高酵母顆粒飼料，給藥時間共21 d。

1.4.5 標本采集 藥物干預第21天給藥2 h后，10%水合氯醛溶液麻醉，腹主動脈取血。5 000 rpm離心10 min，留取血清置于-80℃冰箱待測。取大鼠雙腎，觀察腎臟外觀并稱重，之后迅速將大鼠右腎置于-80℃冰箱里待測，左腎用4%多聚甲醛溶液固定，用于病理切片。

1.4.6 指標檢測 計算大鼠腎臟指數(shù)（雙腎重量/大鼠體重）；并嚴格按照試劑盒說明書的步驟檢測SUA、SCr、BUN 水平。

1.4.7 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎臟病理變化將固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi)的大鼠左腎進行脫水和石蠟包埋后制作切片（4 μm）行HE染色，在正置顯微鏡下觀察其病理變化情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料符合正態(tài)分布者以均數(shù)±標準差（±s）方式表示，多組間計量資料的比較采用方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 與空白組相比，模型組大鼠毛色干枯缺乏光澤感，精神萎靡，活動減少，體質(zhì)量增長緩慢，并逐漸出現(xiàn)多飲癥狀，小便氣味相對刺鼻；陽性對照組和益腎健脾泄?jié)釡髦委熃M以上癥狀和體征均有不同程度的改善。

2.2 腎臟外觀 空白組大鼠腎臟外觀呈深褐色，表面光滑且有光澤；模型組大鼠腎臟體積膨大，外觀呈咖啡色，密布白色顆粒狀小點，無光澤感；較之模型組，陽性對照組和益腎健脾泄?jié)釡?、中、低劑量組大鼠腎臟外觀均有改善，顏色和體積介于空白組與模型組之間，白色顆粒狀小點散布于表面。其中，益腎健脾泄?jié)釡?、中劑量組損傷程度相對較輕；而非布司他組較益腎健脾泄?jié)釡M的體積稍大，顏色更淺，白色小點更密集，見圖1。

圖1 大鼠腎臟外觀

2.3 大鼠體質(zhì)量變化 給藥前，與空白組相比，其余各組造模大鼠體質(zhì)量增長緩慢（P<0.05）；給藥后，與空白組相比，模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢（P<0.05），與模型組相比，益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.05），非布司他片組和益腎健脾泄?jié)釡?、低劑量組大鼠體質(zhì)量有不同程度的增長，但差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.4 大鼠腎臟指數(shù) 與空白組比較，模型組大鼠的腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，非布司他片組和益腎健脾泄?jié)釡鲃┝拷M大鼠腎臟指數(shù)均顯著降低（P<0.05），其中益腎健脾湯中劑量組腎臟指數(shù)最低，但尚未降至空白組水平，見表2。

2.5 大鼠血清SUA、SCr、BUN水平 與空白組比較，模型組大鼠 SUA、SCr、BUN 顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，非布司他片組、益腎健脾泄?jié)釡摺⒅?、低劑量組大鼠SUA顯著降低（P<0.05），其中非布司他片組SUA水平最低，但尚未降至空白組水平（P<0.05）；非布司他片組、益腎健脾泄?jié)釡?、中劑量組大鼠SCr顯著降低（P<0.05），益腎健脾泄?jié)釡蛣┝拷M大鼠SCr有下降趨勢，但與模型組無統(tǒng)計差異，其中益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷MSCr水平最低，接近空白組水平；非布司他片組和益腎健脾泄?jié)釡鲃┝拷M大鼠BUN均顯著降低（P<0.05），其中益腎健脾泄?jié)釡邉┝拷M大鼠BUN水平最低，接近空白組水平，見表3。

表1 大鼠體質(zhì)量變化的比較（±s，n=8）

表1 大鼠體質(zhì)量變化的比較（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別劑量/（g·k g-1）給藥前/g給藥后/g空白組模型組非布司他片組益腎健脾泄?jié)釡邉┝拷M益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M益腎健脾泄?jié)釡蛣┝拷M- -0.0 0 3 6浸膏5.8 6+三七粉0.5 4浸膏2.9 3+三七粉0.2 7浸膏1.4 7+三七粉0.1 4 2 6 6.6 3±1 6.6 2 2 0 9.1 3±1 7.6 8*2 1 0.6 3±1 6.7 2*2 1 0.2 5±1 7.2 9*2 1 1.8 8±1 8.2 2*2 1 5.0 0±1 7.7 7*4 6 4.6 3±2 7.9 2 3 8 5.1 3±3 0.4 6*4 1 9.3 8±5 0.7 5*4 0 0.0 0±3 4.9 8*4 1 9.6 3±2 5.7 8*#3 9 0.2 5±2 6.6 7*

表2 大鼠腎臟指數(shù)的比較（±s，n=8）

表2 大鼠腎臟指數(shù)的比較（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別劑量/（g·k g-1）腎臟指數(shù)/（m g·g-1）空白組模型組非布司他片組益腎健脾泄?jié)釡邉┝拷M益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M益腎健脾泄?jié)釡蛣┝拷M- -0.0 0 3 6浸膏5.8 6+三七粉0.5 4浸膏2.9 3+三七粉0.2 7浸膏1.4 7+三七粉0.1 4 6.0 6±0.5 7 9.6 5±0.5 8*7.1 2±0.5 4*#7.4 4±0.6 9*#6.7 7±0.3 4*#7.5 3±0.6 5*#

表3 大鼠血尿酸、腎功能的比較（±s，n=8）

表3 大鼠血尿酸、腎功能的比較（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別劑量/（g·k g-1）血尿素氮/（μ m o l·L-1）空白組模型組非布司他片組益腎健脾泄?jié)釡邉┝拷M益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M益腎健脾泄?jié)釡蛣┝拷M- -0.0 0 3 6浸膏5.8 6+三七粉0.5 4浸膏2.9 3+三七粉0.2 7浸膏1.4 7+三七粉0.1 4血尿酸/（μ m o l·L-1）6 7.9 5±5.9 3 1 0 7.8 7±7.8 2*7 6.6 6±4.8 6*#9 6.8 8±8.4 3*#8 0.4 0±6.4 7*#9 9.0 9±8.3 6*#血肌酐/（μ m o l·L-1）6 4.7 6±6.0 1 1 1 0.6 6±7.1 6*8 1.0 9±5.9 5*#8 8.4 5±5.4 7*#6 6.5 4±7.8 0#9 7.9 1±1 2.1 6*2.5 7±0.4 1 4.8 0±0.4 5*3.8 3±0.2 3*#3.1 4±0.1 1#3.2 8±0.2 2*#3.9 2±0.2 1*#

2.6 大鼠腎臟病理改變情況 空白組大鼠腎臟組織未見明顯病理病變；模型組大鼠腎臟病變較為嚴重，可見腎小管排列紊亂、變性壞死，部分腎小管有不同程度的擴張，管壁結(jié)構(gòu)模糊，部分管腔內(nèi)還可見細胞管型或蛋白管型，以及均質(zhì)紅染的蛋白樣物質(zhì)沉積或壞死細胞團；壞死區(qū)間質(zhì)有較多以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤和纖維組織增生。較之模型組，非布司他片組、益腎健脾泄?jié)釡鲃┝拷M大鼠腎臟的病變程度相對較輕，其中，益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M大鼠腎臟病變相對最輕，見圖2。

圖2 大鼠腎臟病理損傷情況（HE染色，×200）

3 討論

痛風性腎病因機體嘌呤代謝紊亂，血尿酸生成增多和（或）腎臟排泄尿酸障礙，致體內(nèi)血尿酸水平升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎小管和腎間質(zhì)，進而引起炎癥反應及腎間質(zhì)纖維化，損傷腎臟，最終可導致慢性腎功能衰竭[7]。

中醫(yī)學認為“痛風性腎病”屬于“痹癥”“痛風”“歷節(jié)”“淋證”“水腫”“腰痛”等范疇。關于GN的病因病機，無確切記載，尚無統(tǒng)一標準。因GN的發(fā)病基礎為痛風（高尿酸血癥），故談及GN的病因病機大多從痛風來論。彭江云教授認為該病是因脾腎功能失調(diào)，脾主運化功能失司，腎之溫煦、主水功能失常，膀胱氣化無權(quán)，釀生“痰”“濕”“瘀”等病理產(chǎn)物，滯留經(jīng)脈，聚積腎絡而致。因此，針對脾腎不足、痰濕瘀阻的病因病機，治宜益腎健脾、泄?jié)峄觥?/p>

益腎健脾泄?jié)釡骄渣h參健脾益氣；臣以熟地黃、生薏苡仁，熟地補腎固本、滋腎水，亦可補先天而養(yǎng)后天，以助君藥黨參加強補益脾胃之功；生薏苡仁健脾利水、滲濕除痹，既健運中焦、滲濕利水，除濕邪止痹痛，使GN水濕之邪從小便而去，又可助君藥黨參益氣健脾。佐以女貞子、墨旱蓮滋陰益腎，三七活血化瘀，白術(shù)、貓須草、車前草淡滲脾腎之濕濁。全方諸藥合用，共奏益腎健脾、泄?jié)峄鲋Α?/p>

現(xiàn)代藥理學研究表明黨參具有降低SUA和SCr、BUN[8-10]、保護腎臟[11-12]的作用；熟地黃具有抗炎、減少尿蛋白和改善腎臟功能的作用[13]。薏苡仁可抗腎間質(zhì)纖維化[14]。二至丸可通過干預嘌呤代謝、上調(diào)足細胞裂孔膜蛋白CD2AP等途徑保護腎功能[15-16]。白術(shù)可降低大鼠的SCr、BUN和尿蛋白[17]。貓須草又名腎茶，具有良好的降SUA、排結(jié)石、保護腎功能的作用[18]。車前草具有利尿[19]、降SUA[20]的作用。

本實驗研究結(jié)果顯示益腎健脾泄?jié)釡筛纳艷N模型大鼠腎臟外觀的光滑度和光澤度，降低腎臟指數(shù)；同時降低GN模型大鼠SUA、SCr、BUN水平，改善模型大鼠腎臟組織病理改變程度。觀察3種不同劑量濃度的浸膏對GN模型大鼠腎臟指數(shù)以及SUA、SCr、BUN水平影響，發(fā)現(xiàn)益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M降低大鼠腎臟指數(shù)以及SUA、SCr的效果優(yōu)于高、低劑量組，對BUN的影響雖然高劑量組較中、低劑量組效果相對更好，但結(jié)合各組大鼠腎臟外觀和腎臟病理的改變，發(fā)現(xiàn)益腎健脾泄?jié)釡袆┝拷M對大鼠腎臟的保護作用較高、低劑量組效果更好，表明3種不同浸膏劑量濃度的中劑量為保護GN模型大鼠的最佳劑量。本實驗研究的浸膏濃度與保護腎臟之間的關系并非給藥濃度越高護腎效果越好，可能因腎臟乃代謝性器官，益腎健脾泄?jié)釡珵橹兴帍头?，藥物相對較多，劑量較大（每劑原藥材316 g），GN大鼠腎臟受損時，殘余腎單位腎小管的高代謝引起腎小管氧耗量增加以及氧自由基增多，造成腎小管-間質(zhì)損傷，腎單位進行性損害[21]。

綜上所述，益腎健脾泄?jié)釡山档虶N模型大鼠的SUA、BUN、SCr水平，減輕其腎臟病理損傷，對GN模型大鼠腎臟具有保護作用。然而本文尚未對其作用機制進行相關研究，下一步將開展益腎健脾泄?jié)釡珜N模型大鼠相關機制途徑的研究。