蘇日娜，樊萬君，張自強，何淑旺，姚 靜*

（1中國藥科大學藥學院，南京210009；2南京澤恒醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司，南京210046；3山東達因海洋生物制藥股份有限公司，榮成264300）

阿奇霉素（azithromycin，AZI）是由紅霉素衍生的半合成氮雜內酯類抗生素，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有效［1］。臨床上因其抗菌譜廣、安全性好和易吸收等特點不僅廣泛用于成人患者，還可用于嬰幼兒患者。由于AZI味道極苦，給藥劑量大，兒童患者適口性差，會導致服藥不準確甚至治療效果不佳。除具有苦味之外，AZI口服給藥時還會出現(xiàn)惡心、痙攣、腹瀉和嘔吐等胃腸道不良反應［2］。因此，研究開發(fā)一種改善AZI 苦味，提高患者接受度與降低不良反應的制劑極為重要。

最近研究表明，穩(wěn)定性好且便于貯存與攜帶的微型固體制劑更為適合兒科患者［3-7］，其中微球劑量靈活性高、載藥量大，適合給藥劑量大并具有不同給藥方案的抗生素類藥物。不僅如此，微球粒徑范圍小、易于吞咽，在一項不同粒徑多微粒體系評價中，小粒徑范圍微粒服用需水量與口腔殘留少，在成人與兒童群體中服用意愿與接受度更高［8］。與此同時，微球可通過載體材料的特性進行包衣，制備口腔速崩片等達到掩味、緩控藥物釋放，提高制劑靈活性，從而適合不同年齡段或不同吞咽能力患者。乙基纖維素（ethylcellulose，EC）是制備微球常用的可降解、生物相容性良好的緩釋載體材料，可以減少口腔中藥物釋放而達到掩味效果，藥物從EC 微球中的緩慢釋放可降低胃腸道中藥物濃度，從而降低藥物的胃腸道不良反應［9-10］。

因此，本研究采用EC 為載體材料，以O/W 乳化溶劑揮發(fā)法制備阿奇霉素載藥微球（AZI-EC MS），通過混合不同相對分子質量EC 為載體的簡易方法解決其突釋問題并初步探討釋藥機制。確定AZI苦味閾值濃度，得出苦味評價擬合方程并評價AZI-EC MS 掩味效果，旨在制備改善AZI 苦味，提高患者順應性的口服微球，為AZI 制劑研究與AZI苦味評價奠定基礎。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

阿奇霉素原料藥（湖北展望藥業(yè)有限公司，純度99%）；乙基纖維素［型號：AqualonTMT10（Mr75 kD）、N22（Mr140 kD）、N50（Mr160 kD），美國亞什蘭公司］；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

島津CTO-10ASUP高效液相色譜儀（日本島津公司）；PB-10 pH 計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；OS20-Pro 置頂式攪拌器（美國Scilogex 公司）；SHA-B 水浴恒溫振蕩器（精達有限公司）；ZRS-6G 智能溶出試驗儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；DSC200F3 差示掃描量熱儀（德國耐馳公司）；S-3400N掃描電鏡儀（日本Hitachi公司）。

2 方 法

2.1 AZI-EC MS的制備

采用O/W 乳化溶劑揮發(fā)法制備AZI-EC MS。精密稱取EC 0.5 g 溶于二氯甲烷10 mL，待其完全溶解后，精密稱取AZI 0.5 g 加至上述溶液作為油相，勻速滴入至高速攪拌的0.1 % SDS 水相，攪拌揮發(fā)一定時間后，過濾沖洗微球，烘干至恒重后收集微球。連續(xù)過100 目和200 目篩取75～154 μm范圍AZI-EC MS。

2.2 載藥量的測定

色譜條件：C18色譜柱，流動相：0.1 mol/L 磷酸氫二鉀（20%磷酸調至pH 8.2）-甲醇（25∶75），檢測波長：210 nm，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量20 μL。

精密稱取適量AZI-EC MS 于2 mL 量瓶，加入二氯甲烷待溶解完全后定容至刻度，搖勻后精密移取1 mL 至10 mL 量瓶以流動相定容至刻度，過膜取續(xù)濾液進HPLC 測定。計算載藥量：載藥量（%）=所含藥物重量/微球總重×100。

2.3 體外釋放度測定

稱取適量AZI-EC MS（含AZI 125 mg），以新鮮脫氣磷酸氫二鈉（pH 6.0）500 mL 為釋放介質，溫度（37±0.5）℃，轉速100 r/min 測定釋放度。于時間點0.5、1、3、6、8 h 取樣5 mL 并補充同溫同體積介質，過濾后取續(xù)濾液進HPLC 測定，繪制累計釋藥曲線。

2.4 EC-AZI MS表征

2.4.1 DSC 分析 取AZI、EC（T10）、EC（N22）、AZI 與EC（T10）和EC（N22）物理混合物（EC（N22）與EC（T10）質量比為7∶3，藥載質量比為1∶1）、ECAZI MS（EC（N22）與EC（T10）質量比為7∶3，藥載質量比為1∶1）樣品約5 mg 于鋁坩堝中，以升溫速率10 ℃/min，升溫范圍30～300 ℃條件進行分析，繪制DSC曲線圖。

2.4.2 FTIR 分析 分別將AZI、EC（T10）、EC（N22）、AZI-EC MS［EC（N22）與EC（T10）質量比為7∶3，藥載質量比為1∶1］樣品1～2 mg 在400～6 000 cm-1范圍內進行分析，繪制紅外光譜圖。

2.4.3 SEM 分析 使用導電膠分別將空白微球［EC（N22）與EC（T10）質量比為7∶3］與AZI-EC MS［EC（N22）與EC（T10）質量比為7∶3，藥載質量比為1∶1］固定在銅板上，金粉涂覆導電掃描并拍照，掃描電鏡觀察微球形態(tài)與表面。

2.4.4 體外模擬口腔pH 介質內釋放研究 以經(jīng)脫氣處理的新鮮配制pH 7.4 磷酸氫二鈉5 mL 為模擬口腔pH 的釋放介質，介質溫度為（37±0.5）℃，設恒溫振蕩器轉速50 r/min，取藥物/載體比例為1∶1、2∶1和3∶1處方載藥微球以及AZI原料藥（pure drug）適量（含AZI 125 mg）進行體外釋放實驗。于1、3 和5 min 分別取液1 mL 并及時補充相同體積等溫介質，樣品經(jīng)0.22 μm 水系濾膜，取續(xù)濾液適量加流動相稀釋后進HPLC測定。

2.4.5 AZI 閾值測定與苦味評價 取適量AZI 原料藥粉末，以純凈飲用水配制4.97、9.93、14.9、19.9、29.8、48.5和99.3 μg/mL等一系列質量濃度后，由7 位19～25 歲健康成人志愿者組成的小組進行AZI 人體苦味閾值測試。要求志愿者以純凈水漱口后，取適量AZI 溶液含至口腔中，并將舌頭左右前后轉動至溶液與舌苔充分接觸，30 s后吐掉并用純凈水漱口數(shù)次，同法依次測試濃度遞增的AZI 溶液。志愿者對不同濃度AZI 溶液的苦味意見根據(jù)苦味量表評分?？辔读勘碛? 為“無味”、1為“微苦”、2 為“中苦”和3 為“強烈苦味”4 種標準組成。記錄志愿者評分并確定AZI苦味閾值。

為得到苦味評分與AZI濃度之間的數(shù)量關系，將所得志愿者平均評分與AZI 濃度對數(shù)作多項式擬合［11］，得到lgC（AZI）與志愿者評分之間的關系。在此多項式擬合方程結果下，根據(jù)模擬口腔pH 條件下進行的釋放度測定結果進行苦味評價計算。

3 結果與討論

3.1 AZI-EC MS的制備

以EC（T10）、EC（N22）、EC（N50）等不同相對分子質量EC 為載體，制備載藥微球。當藥載質量比1∶1 時，分別以T10、N22 和N50 型號EC 為載體制 得 微 球 的 載 藥 量 依 次 是（42.57±1.71）%、（47.66±0.85）%和（49.10±1.87）%。另外，如圖1-A 所示，EC 相對分子質量會影響微球釋藥速率；其中EC（T10）微球在0.5 h突釋率可達85%，1 h釋放量達到90%以上，而EC（N22）型在各個時間點釋放量均高于EC（N50），8 h 釋放量分別為62%和54%。這說明EC相對分子質量能夠影響微球釋藥行為，相對分子質量越大，藥物釋放越緩慢，這可能是因為隨著聚合物相對分子質量增加，其鏈長增加，導致更強的韌性，使載藥微球中的藥物與載體更為緊密。

進一步制備以不同比例混合EC（N22/T10）為載體，藥載質量比為1∶1 的微球，其釋藥結果如圖1-B 所示，隨著EC（T10）比例降低，其釋藥速率變慢，EC（N22）/EC（T10）比例5∶5和6∶4微球在0.5 h釋放量將近80%，3 h 釋放量可達到90%，而比例7∶3 和9∶1 的0.5 h 均未突釋，8 h 釋放量分別可達90%和60%左右。不同型號EC 的混合比例對載藥量無明顯影響。而以EC（N22/T10，7∶3）為載體的微球隨藥載質量比提高，微球釋藥速率與載藥量增加（如圖1-B和圖1-C所示）。

Figure 1 Effect of molecular weight of ethylcellulose(EC) and ratio of azithromycin(AZI)/EC on cumulative drug release(A and B) and drug loading efficiency of AZI-EC microspheres(MS)(C)(±s,n=3)**P＜0.01; a formulation with AZI/EC ratio(1∶1); b formulation with EC(N22/T10,7∶3)

綜合考慮突釋（0.5 h釋放量小于40%）和累計釋放百分率（8 h 內釋放量可達90%），確定藥載質量比為1∶1，以混合EC（N 22/T 10，7∶3）為載體制備AZI-EC MS。

3.2 釋藥機制研究

緩釋微球釋藥原理主要包括溶出、擴散、溶蝕等。擴散原理又包括透膜擴散（零級釋放）、膜孔擴散（接近零級）和骨架材料擴散（非零級釋放，Higuchi擴散模型）。將微球釋藥曲線與零級釋放、Hixson crowell 溶蝕模型、Baker-lonsdale 球形擴散模型和Higuchi 擴散模型等釋藥模型方程進行擬合，討論微球釋藥機制。如表1 所示，微球釋藥過程與零級釋放模型擬合程度均較差；而EC（N22）、EC（N 22/T 10，9∶1）處方為Baker-lonsdale 球形擴散模型擬合度相對高，其余均與Higuchi 擴散模型擬合相對高，這說明微球釋藥是通過骨架材料擴散而非透膜擴散，藥物通過EC 骨架孔道以濃度梯度為驅動進行釋放。

Table 1 Fitting results of the in vitro release data to various release kinetic models from different microsphere formulations

3.3 AZI-EC MS表征與性質評價

3.3.1 DSC和FTIR 分析 DSC分析結果如圖2-A所示，EC（N22）和EC（T10）在53 ℃處有吸熱峰，AZI 原料藥在128 ℃與253 ℃處有明顯吸熱峰，物理混合物則分別出現(xiàn)AZI、EC（N22）和EC（T10）的特征吸熱峰，而AZI-EC MS 在128 ℃與253 ℃處未見AZI 特征吸熱峰，且53 ℃處載體特征吸熱峰有變 寬 趨 勢；FTIR 結 果 如 圖2-B 所 示，AZI 在1 725.1 cm-1處有羰基伸縮振動，而AZI-EC MS 光譜與EC（N22）和EC（T10）紅外光譜相似，并且在1 729.6 cm-1出現(xiàn)AZI 羰基伸縮振動，有變寬趨勢。上述結果說明，AZI-EC MS 中EC 與AZI 沒有形成新化學鍵，但是存在分子間作用力。

3.3.2 SEM 形態(tài)觀察 如圖3 所示，空白微球與AZI-EC MS 整體成球效果均良好，形態(tài)相似，且粒徑較均勻，而相比空白微球，AZI-EC MS 表面較粗糙，但仍未觀察到藥物結晶析出，這可能是由于藥物的加入，使載體之間的作用有所改變而導致的。此外，放大后觀察球表面結構（圖3-C 和3-F），結果顯示，由于在微球過程中溶劑揮發(fā)，在空白微球與AZI-EC MS表面均有大量的微小孔洞，而得益于這些孔洞，藥物以濃度梯度為驅動力擴散釋放。

Figure 2 DSC traces（A）and FTIR spectra（B）of AZI-EC MS(a),EC（N22）(b),EC（T10）(c),AZI(d)and physical mixture(e)

Figure 3 Typical SEM images of blank EC MS (A),single blank EC MS (B),surface of blank EC MS (C),AZI-EC MS (D)singleAZI-EC MS(E),surface of AZI-EC MS(F)

3.3.3 體外模擬口腔pH 內釋放分析 接近唾液實際體積和pH 的釋放介質能夠更好地模擬口腔環(huán)境。一般唾液pH 范圍在5.5～7.4 之間，其中，1～12 月小兒唾液pH 范圍為5.7～7.0，大于pH 7.0時與小孩和成人唾液呈密切相關［12］。因此，本實驗采用pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液為釋放介質。如圖4 所示，與原料藥相比，在藥物/載體比例高達3∶1時，AZI-EC MS在5 min時釋藥量仍低于5%，說明微球明顯阻滯了藥物在口腔中的釋放，有助于提高適口性。

3.3.4 AZI 閾值測定與苦味評價 志愿者評價AZI 原料藥苦味結果如圖5-A 所示，在本實驗條件下AZI人體苦味閾值濃度為9.93 μg/mL，等于或低于該濃度時口腔內口感為無味。

Figure 4 Dissolution profiles of different drug/polymer ratio EC microspheres,37°C,pH 7.4 dissolution medium(±s,n=3)

Figure 5 Taste scores assigned by human volunteers to different azithromycin solutions(A) and the polynomial relationship with calculation score of pure drug and AZI-EC MS formulations(B)

為得到志愿者評分與AZI 濃度之間的數(shù)量關系，將所得志愿者平均評分與AZI濃度對數(shù)作多項式擬合，得到lgc（AZI）與志愿者評分之間擬合方程為：Y=0.848 6X2-0.353 1X-0.411（R2=0.976 6）。其中，Y為苦味得分，X為lgc（AZI）。

根據(jù)該多項式擬合方程，分別利用AZI、不同藥載質量比處方微球在pH 7.4 介質內1 min 時的釋放濃度計算苦味得分。多項式擬合曲線與計算結果如圖5-B 所示，AZI 在1 min 內釋放藥物濃度高，其苦味評分遠遠高于強烈苦味值，而載藥微球即使在藥載質量比為3∶1 情況下也遠低于AZI 的苦味程度，且隨著藥載質量比的降低，其苦味程度降低，其中在藥載質量比為1∶1 時口腔內停留1 min 時釋藥濃度可介于微苦程度，掩味效果良好。

4 結 論

改善苦味與服藥順應性在提高患者接受度及治療效果方面具有重要意義。一項針對800 多名兒科醫(yī)生的調查報告顯示，90.8%的急性病患者和83.9%的慢性病患者的依從性障礙主要是由藥物不良口感引起的［3］。患者接受度與口感有關之外，還與可吞咽性相關，如制劑體積、給藥量和劑型均會影響可吞咽性。因此，本實驗針對劑量大且具強烈苦味的AZI，采用EC為載體，以O/W 乳化溶劑揮發(fā)法制備AZI-EC MS 微球，其載藥量高、劑量靈活性好、易于吞服、掩味效果良好。AZI-EC MS 制備方法簡單，可有效控制藥物釋放和改善AZI 適口性，能夠明顯提高患者用藥順應性，為該類新劑型研究奠定基礎。