陶穎君，吳 潔，劉 暢

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京211198）

1 蛋白質組學及其研究方法

蛋白質組學本質是在大規(guī)模水平上對蛋白質進行研究，包括蛋白質表達、翻譯后修飾、蛋白質間相互作用等［1］。通過全面篩選復雜的蛋白質，測量多種蛋白質變化并運用大量生物信息學技術等，提供蛋白質表達改變的定性和定量證據(jù)［2］，最終整體而全面地認識蛋白質水平上疾病的發(fā)生以及細胞的變化等過程。

目前研究蛋白質組學主要的方法包括雙向凝膠電泳（2-DE）、高效液相色譜（HPLC）、飛行時間質譜（TOF-MS）、同位素親和標簽（SID-MRM）、半定量多反應監(jiān)測（SQ-MRM）和生物信息學技術等，其中最常用的是雙向凝膠電泳和高效液相色譜法。雙向凝膠電泳是一種多功能的基于凝膠的技術，可以對蛋白質進行定性和定量分析。通過凝膠圖像分析顯示不同樣品或條件之間差異表達的斑點，結合質譜則可以進一步識別所選斑點中存在的蛋白質從而實現(xiàn)對蛋白質的鑒定［3］（如圖1）。高效液相色譜以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)實現(xiàn)對樣品的分析，在典型條件下與質譜儀在線耦合，從而對分析柱中洗脫的肽或蛋白質直接進行定性或定量分析［4］。隨著更多更好性能的質譜儀逐漸普及，并行反應監(jiān)測（PRM）和質譜連續(xù)窗口分段式掃描技術（SWATH）可以提供關于不同條件下更多蛋白質組變化的定性和定量數(shù)據(jù)，監(jiān)測各種條件下個體蛋白質相對或絕對水平的變化，從而為生物標志物研究提供更多有價值的信息［5］，并且為蛋白質組學的研究提供了便利。

圖1 蛋白質組學雙向凝膠電泳（2-DE）檢測示意圖

2 糖尿病

1 型糖尿?。═1D）是一種慢性自身免疫性疾病，是由胰島β 細胞，免疫系統(tǒng)和遺傳易感個體的外部環(huán)境之間復雜的相互作用引起的［6-7］，占我國糖尿病10%左右。2 型糖尿病（T2D）是以胰島功能受損、胰島素抵抗為主要病因而導致的胰島素相對缺乏，受后天生活習慣影響很大，線粒體呼吸活動受損會導致T2D 胰島素抵抗的發(fā)展［8］。我國T2D 占糖尿病的90%左右。糖尿病可導致嚴重的健康問題，尤其是心血管和腎臟并發(fā)癥［9］，是糖尿病患者死亡更主要的原因。由于并發(fā)癥的致死性威脅，早期診斷顯得尤為重要，其有助于控制患者的病情發(fā)展甚至免于手術治療，對于改善患者預后具有重要意義。而蛋白質組學的發(fā)展也為糖尿病早期診斷提供了新的研究方向及可能。

3 蛋白質組學與糖尿病及其并發(fā)癥

3.1 蛋白質組學在糖尿病診斷與致病機制研究中的應用

目前，在臨床癥狀發(fā)作前用于預測是否有患T1D 風險的最佳方法是測量胰島細胞抗原的自身抗體［10］。這些自身抗原包括谷氨酸脫羧酶（GAD）、蛋白酪氨酸磷酸酶（IA-2）、胰島素以及鋅轉運蛋白ZnT8等。盡管多年來自身抗體檢測的性能已大大提高，但并非所有胰島自身抗體陽性受試者都進展至T1D，而且T1D中胰島自身抗體的致病作用仍然難以捉摸［11］，所以無法有效預測T1D的發(fā)生，但是近年來隨著蛋白質組學的飛速發(fā)展，對于T1D 的診斷也有了新的進展。Soggiu 等［12］采用高分辨率雙向凝膠電泳分離T1D 患者和健康受試者的尿蛋白，并通過LC-MS/MS 進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的尿蛋白之間存在差異，其中Tamm-Horsfall尿糖蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白E、α2-硫醇蛋白酶抑制劑和人補體調節(jié)蛋白CD59等5種蛋白質被下調，而α-1-微球蛋白、鋅-α2糖蛋白、α-1B 糖蛋白和視黃醇結合蛋白4等4種蛋白質被上調。

Huth 等［13］運用蛋白質組學對與T2D 預測及早期診斷相關的蛋白質進行了鑒定。團隊選擇了892 名年齡在42～81 歲之間的受試者，其中包括123 位T2D 患者和255 位WHO 定義的糖尿病前期患者。得出了甘露聚糖結合凝集素絲氨酸肽酶（MASP）水平與T2D 和前驅糖尿病呈正相關。脂聯(lián)素與T2D 發(fā)病呈負相關。 MASP、脂聯(lián)素、載脂蛋白A-IV、載脂蛋白C-II和C反應蛋白等與預后相關。這些研究在蛋白質水平上給糖尿病的預測方法提供了一個新的方向。

近年來的研究表明，T1D的發(fā)生與人類腸道病毒尤其是柯薩奇B 組病毒（group B Coxsackie viruses，CVB）的感染關系密切。Lietzén 等［14］利用基于質譜的蛋白組學研究了CVB 持續(xù)感染人胰腺細胞后對細胞內蛋白表達和分泌的影響，發(fā)現(xiàn)會導致一系列廣泛的變化，包括線粒體網絡形態(tài)、能量代謝、分泌途徑調節(jié)以及抗病毒免疫反應蛋白的表達。該研究結果為T1D 的病毒致病機制提供了信息和新的研究思路。

3.2 蛋白質組學在糖尿病并發(fā)癥診斷中的應用

3.2.1 糖尿病視網膜病變（DR） 糖尿病視網膜病變（DR）是由糖尿病引起的常見微血管并發(fā)癥，這種病癥是血管起源的，其特征是視網膜缺血以及血管通透性增加，是成人T1D 患者視力損害和喪失的主要原因，它在一定程度上最終影響超過90%的糖尿病患者［15-16］。DR 可以在沒有任何嚴重癥狀的情況下發(fā)展，引起視力減退，目前主要治療方法是視網膜光凝術和玻璃體視網膜手術［17］，若能及早發(fā)現(xiàn)，則可通過控制系統(tǒng)性危險因素，如高血糖、高血壓和血脂異常等［18］改善臨床癥狀避免手術。因此DR 的早期發(fā)現(xiàn)至關重要，亟需盡快改進DR 的診斷篩查方法。Jin 等［18］進行了一項全面的蛋白質組學研究，以確定DR 的生物標志物。其通過使用SQ-MRM 和SID-MRM 分析糖尿病無視網膜病變、輕度和中度非增殖性視網膜病變的患者血漿，得出了4 種蛋白分子：載脂蛋白APO4、C7、CLU 和ITIH2，可作為早期DR 的新型生物標志物，但是該研究需使用更大的蛋白質組進行進一步驗證。除此之外，由于淚液可非侵入性收集且含有相對高的蛋白質濃度，故其可成為發(fā)現(xiàn)生物標志物的良好來源，有助于早期診斷，因此淚液蛋白質組學可以作為一種潛在的新型人群篩查工具［19］。Cs?sz 等［5］在單一系統(tǒng)中使用微動脈瘤檢測器結合淚液蛋白質組學提高了糖尿病視網膜病變篩查方法的敏感性和特異性。運用蛋白質組學技術檢查淚液，已經鑒定出多種蛋白質作為糖尿病視網膜病變不同階段的可能生物標志物，而這些生物標志物或許能夠改進已有的DR檢測篩查方法。

3.2.2 糖尿病腎?。―N） 糖尿病腎?。―N）是由于糖尿病影響體內葡萄糖平衡而引起的嚴重并發(fā)癥［20］。它已成為發(fā)達國家慢性腎病最常見的原因［21］。在DN 領域的臨床實踐和研究中，尿微量白蛋白（MAU）的概念至關重要。然而，近年來僅僅基于MAU診斷DN的方法受到質疑。雖然MAU的絕對水平和變化率與DN 的發(fā)生和進展有關，但其本身缺乏準確預測糖尿病腎病的敏感性或特異性［22-23］。de Boer等［24］在糖尿病控制和并發(fā)癥試驗/糖尿病干預和并發(fā)癥流行病學（DCCT/ EDIC）研究中量化了MAU異常變化后長期腎臟轉歸的發(fā)生率和危險因素。DCCT 隨機分配了1 441 名T1D 患者進行強化或常規(guī)糖尿病治療，并在觀察性EDIC研究期間對參與者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性MAU發(fā)展之后，腎臟疾病的進展和消退通常都會發(fā)生。同時，其他縱向觀察性研究發(fā)現(xiàn)在兒童和成人的T1D和T2D患者中也具有相似的現(xiàn)象［25］。因此，這些研究表明MAU 可能不是研究DN 進展的理想標志［26］。而且，雖然腎組織病理學活檢分析能準確診斷糖尿病患者的組織學損傷，但大多數(shù)醫(yī)療中心并不經常進行腎活檢分析［27］。所以，除MAU 和腎活檢外，需要尋找更加準確有效的非侵入性生物標志物用于DN的早期診斷。

現(xiàn)已有多種研究蛋白質組學的方法用于DN診斷，如2-DE、LC-MS/MS、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、蛋白質微陣列和芯片上的微流體技術等［28］。Hirao 等［20］通過LC-MS/MS 對無微量白蛋白尿的糖尿病患者和健康受試者的尿蛋白質組進行全面分析，采用無標記半定量法和基因本體論分別對健康受試者尿液中的942 種蛋白質和糖尿病患者尿液中的645種蛋白質進行鑒定分析，通過圖2 嚴格鑒定的蛋白質組韋恩圖可以看出，有327種蛋白質是健康人群特有的，30種蛋白質是糖尿病患者特有的，兩類人群共有615 種蛋白質［20］。通過所測蛋白質在患者和健康人尿液中的調節(jié)水平來闡明變化途徑，希望可以發(fā)現(xiàn)用于DN 早期診斷的生物標志物。DN 相關蛋白質組學方法的研究對DN 病理生理學的理解和疾病相關生物標志物的鑒定起到了關鍵作用［29］。

圖2 糖尿病患者（DM）與健康受試者（HV）蛋白差異鑒定韋恩圖

3.2.3 糖尿病心肌?。―C） 心血管疾病包括糖尿病心肌病、心血管自主神經病變、高血壓以及冠狀動脈心臟病變等致使超過10%的T1DM 患者在40歲之前死亡［30］。秋田小鼠（Akita Ins2WT/C96Y）是一種類似于人類T1DM 進展的小鼠模型，其在5周時會出現(xiàn)明顯的心臟萎縮，是研究DC 的理想模型。Dewey 等［31］對秋田小鼠DC 的發(fā)生進行了研究，用無標記蛋白質組學分析5周左右糖尿病小鼠的心臟以鑒定可能在DC 的病理生理學中起關鍵作用的蛋白質。在早期階段，他們發(fā)現(xiàn)GANC、PLEKHN1、COLIA1、GSTK1、EPHX2 等9 種線粒體蛋白質在糖尿病小鼠中存在差異表達，qPCR 結果表明，這些變化主要是由轉錄調控驅動的。而在EPHX2基因的研究中發(fā)現(xiàn)，其在第3周和第4周表達沒有差異，在第5 周和第12 周分別增加50%和100%。此外，免疫印跡顯示12周齡秋田小鼠的腓腸肌組織中由EPHX2編碼的可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）增加約100%（P＜0.01）。研究結果表明，sEH 的增加是DC 發(fā)展的關鍵因素，因此sEH 可用作DC診斷的潛在靶標。

3.2.4 糖尿病周圍神經病變（DPN） 糖尿病周圍神經病變（DPN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，能夠增加潰瘍和下肢截肢的風險，并對生活質量產生嚴重的影響［32］。對DPN 發(fā)病機制的不完全了解在很大程度上阻礙了其有效治療的發(fā)展。一些研究表明，氧化應激特別是由線粒體損傷引起的氧化應激是DPN 的主要誘因［33］。Zhang 等［34］利用蛋白質組學分析線粒體蛋白質譜的變化來研究DPN的發(fā)病機制及唐洛寧（TLN）對其治療的效果。利用相對和絕對定量標記（iTRAQ）與串聯(lián)質譜聯(lián)用對TLN 治療組大鼠與對照組大鼠進行蛋白質定性定量實驗，發(fā)現(xiàn)治療組大鼠與對照組大鼠相比有388 種蛋白差異表達，其中176 種下調，212 種上調。對成模大鼠進行分析發(fā)現(xiàn)有11種線粒體蛋白質（線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶2、烏頭酸酶和線粒體復合物ⅠNADH-輔酶Q 還原酶5 等）受到影響，而經TLN 處理后有4 種蛋白質（線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶2、線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶1、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶）被逆轉，預測這4 種蛋白質可能是TLN 的治療靶點。因此，通過蛋白質組學方法，可以發(fā)現(xiàn)糖尿病中一系列線粒體蛋白所受到的影響，而這些線粒體蛋白的變化可以幫助解釋疾病的發(fā)病機制并確定潛在的治療靶點。

3.2.5 妊娠期糖尿病（GDM） 妊娠期糖尿?。℅DM）是指妊娠期出現(xiàn)的血糖異常，作為產科常見孕期合并癥之一，其對于母嬰均有嚴重的不利影響［13］。臨床報道顯示GDM 產婦母嬰并發(fā)癥發(fā)病率及病死率明顯高于健康產婦，圍產期病死率極高［35］。其可以誘使胎兒發(fā)育紊亂，并使孕婦發(fā)生早產、感染、先兆子癇，未來發(fā)生糖尿病的可能性提高。故需要開發(fā)有效的妊娠篩查工具做好臨床GDM 篩查，識別有發(fā)展GDM 風險的孕婦，做到早診斷早治療［36］，這對于改善母嬰預后具有重要作用。Kim等［36］隨機選擇12名在24～28孕周被診斷為GDM 的孕婦血液作為病例，然后選取相同數(shù)量的16～20 孕周健康孕婦血液作為對照，運用SELDI-TOF-MS 技術進行蛋白質組學分析，證明患有GDM 的婦女載脂蛋白CⅢ水平相比對照組顯著升高。數(shù)據(jù)表明，妊娠期糖尿病婦女母體內在16～20 周時已經存在生物標志物，因此，確定蛋白質生物標志物進而預測GDM的后期發(fā)展是完全可行的。

4 展 望

蛋白質組學為生命科學的許多研究領域開辟了新的視野，成為近年來興起的研究熱點，也為糖尿病的臨床研究提供了強有力的工具，展現(xiàn)出廣闊的應用前景。相信在未來幾年中，隨著精準醫(yī)療的加入，可以使糖尿病的控制更加有效，從而有希望預防其并發(fā)癥和改善糖尿病患者的生活質量［37］。雖然蛋白質組學用于糖尿病研究剛起步，但在β 細胞、玻璃體、骨骼肌和心肌等方面已取得一定成果，預計將有更多新的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，而這些標志物將在血清、血漿和尿液等樣本的臨床試驗中起著關鍵作用［38］。然而，雖然蛋白質組學技術已經被醫(yī)學界廣泛重視，但是仍存在一些問題，如其發(fā)展尚處于初級階段，雖然許多文獻中報告的候選生物標志物彼此緊密相關，但很少有研究試圖同時評估多種生物標志物以確定這些相關生物標志物中最有用的部分［39］。但是隨著質譜等蛋白質組學研究技術的持續(xù)改進以及生物信息學技術的應用，將使基礎技術更易于使用且更具效益，其在醫(yī)學和藥物開發(fā)等領域的應用也會更加廣泛。相信在不久的將來，大規(guī)?；谫|譜的蛋白質組學方法將在糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的研究方面發(fā)揮巨大作用。