李芝艷，劉 婕，李冰艷，江 程*

（1中國藥科大學(xué)江蘇省藥物分子設(shè)計(jì)與成藥性優(yōu)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2中國藥科大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；3中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，南京210009）

Polo 樣激酶家族（polo-like kinases，Plks）是一類結(jié)構(gòu)上高度保守的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞周期進(jìn)程中有重要的調(diào)控作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)Plks主要有5種亞型，即Plk1，Plk2，Plk3，Plk4和Plk5［2］。人類Plks 中，Plk1-4 含有N末端激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD），以及一個(gè)或多個(gè)高度保守的C 末 端polo-box 結(jié) 構(gòu) 域（polo-box domains，PBDs），而Plk5 不含N末端的KD 部分［2］。PBD 是Plks特有的結(jié)構(gòu)，對Plks在亞細(xì)胞中的定位及對底物蛋白識別和磷酸化過程中起到重要作用［2］。

Plk1，Plk2 和Plk3 這3 種亞型的結(jié)構(gòu)相似，而Plk4 與前三者差別較大［3-4］。Plk1 在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，抑制其功能可以引起腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的生長，但對正常細(xì)胞卻沒有明顯影響，因此，Plk1 是新型抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)有效靶標(biāo)，目前也報(bào)道了多種Plk1 抑制劑［5-6］。然而，與Plk1 結(jié)構(gòu)高度類似的兩個(gè)激酶Plk2 和Plk3對保持基因的穩(wěn)定及阻止細(xì)胞癌變具有重要作用，通常被認(rèn)為具有抑制腫瘤生長的作用［7-9］。因此，在研究作用于Plk1 的抑制劑時(shí)，必須考慮如何高 選 擇 性 地 抑 制Plk1 而 不 抑 制Plk2 和Plk3［9-10］。在Plk1 抑制劑中，研究最為廣泛的是作用于ATP結(jié)合位點(diǎn)的ATP 競爭性小分子化合物，目前已有很多化合物進(jìn)入臨床研究（表1），作用于Plk1 PBD的ATP 非競爭性抑制劑也受到了越來越多的關(guān)注［11-12］。PBD 是Plks特有的結(jié)構(gòu)，對Plk1在亞細(xì)胞中的定位及對底物的磷酸化過程中起到重要作用，不同亞型的Plk 磷酸化的底物不同，其PBD 的結(jié)合口袋也不相同，因此以Plk1 PBD 為靶點(diǎn)開發(fā)抑制劑，對于尋找高選擇性的Plk1 抑制劑具有重要意義。

以從Plk1 的底物蛋白PBIP1 中截取的磷酸肽為模板，Lee等［13］報(bào)道了第1個(gè)五肽結(jié)構(gòu)的高活性、選擇性的Plk1 PBD 抑制劑PLHSpT（圖1，化合物1）。此后，一系列擬肽結(jié)構(gòu)的Plk1 PBD 抑制劑被報(bào)道出來（圖1，化合物2～5）［14-19］。本課題組前期也報(bào)道了一些在結(jié)構(gòu)中引入非天然氨基酸，獲得高活性、選擇性的擬肽結(jié)構(gòu)的Plk1 PBD 抑制劑（圖1，化合物6），這些抑制劑的血漿穩(wěn)定性與PLHSpT相比也得到了較大提高［20-22］。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的高活性擬肽結(jié)構(gòu)的Plk1 PBD抑制劑通常含有磷酸基團(tuán)，并且這個(gè)磷酸基團(tuán)被認(rèn)為對于保持化合物的高活性起到了重要作用［12］。然而，磷酸基團(tuán)通過磷酸酯鍵和擬肽化合物骨架相連，這個(gè)部分容易受到細(xì)胞中磷酸酯酶的破壞，同時(shí)，磷酸基的存在降低了化合物的細(xì)胞穿透性，大大降低了化合物對細(xì)胞的作用［18］。用一系列（2S，3R）-2-氨基-3-甲基-4-膦?；∷幔≒mab）摻入肽模擬物，得到的擬肽化合物保留了對Plk1 PBD 的高效抑制作用，同時(shí)還對磷酸酶十分穩(wěn)定［18］。但是由于Pmab 合成難度非常大，給這類擬肽化合物的制備和使用帶來了一定的局限。本研究將五肽中磷酸化的蘇氨酸中的磷酸基替換為羧基，獲得了一系列不含磷酸基團(tuán)的擬肽化合物，為尋找新型的選擇性Plk1 PBD 抑制劑提供了參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

Rink樹脂（替代度SD=0.8 mmol/g）、9-芴甲基氯甲酸酯（Fmoc）、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸鹽（HBTU）、1-羥基苯并三唑（HOBt）和各種氨基酸均購自上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；三氟醋酸（阿拉丁試劑）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，天津化學(xué)試劑廠）；FITC-Probe1（FITC-GPMQSpTPLNG-OH）、FITC-Probe2（FITC-GPMQSpTPKNG-OH）、FITC-Probe3（FITC-GPLASpTPKNGOH）購自上海沐晉生物有限公司；其他試劑均為市售分析純；人類HeLa 細(xì)胞由中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)院提供。

1.2 儀 器

多肽合成反應(yīng)管（北京欣維爾玻璃儀器有限公司）；振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；島津SPD-20A 制備液相色譜儀（日本島津公司）；Thermo Scientific TSQ Quantis 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo-Finnigan公司）。

Figure 1 Representative reported peptidomimetics as Plk1 PBD inhibitors

2 方 法

2.1 擬肽化合物的合成

目標(biāo)化合物的合成采用的是文獻(xiàn)報(bào)道的Fmoc保護(hù)基固相合成法［17］。目標(biāo)化合物合成路線通式見圖2。Rink 樹脂用DMF 溶脹20 min，將Fmoc 保護(hù)的氨基酸（3.0 eq.）、HBTU（3.0 eq.）、HOBt（3.0 eq.）和N，N-二異丙基乙二胺（DIEPA，6.0 eq.）與DMF（1 mL）混合2 min，加入到樹脂中，劇烈振蕩1 h，減壓抽濾掉反應(yīng)液，再用DMF 和DCM交替洗滌樹脂3 次后，加入配制好的封端液（DMF-醋酐-DIPEA，7∶2∶1）1 mL左右，在渦旋振蕩儀上反應(yīng)30 min，再重復(fù)上述洗滌操作。向混合物中加入事先配制好的Fmoc 脫保護(hù)溶液（DMF-哌啶，4∶1）2 mL，在渦旋振蕩器上振蕩反應(yīng)10 min，減壓抽濾掉溶液，再用DMF、DCM 交替洗滌3 次，再加入脫Fmoc 溶液2 mL，振蕩15 min 后，重復(fù)上述洗滌步驟洗滌之后，用刮刀取少量置于試管中，加入幾滴配制好的5%苯并茚三酮溶液，100 ℃水中煮沸2 min 后，樹脂顯藍(lán)紫色則表示Fmoc 脫除完畢，如樹脂顯無色透明狀，或者淺紅色則需再加脫Fmoc 溶液，振蕩，直到Fmoc 脫除完全，才可進(jìn)行下步操作。用后續(xù)連接需要的不同“砌塊”重復(fù)以上偶聯(lián)-脫保護(hù)過程，直至完成所需擬肽鏈的合成。將合成結(jié)束后的樹脂用DMF 洗滌2 次，減壓抽濾掉DMF，盡可能地抽干溶液，然后加入冰三氟醋酸2 mL 左右，搖晃使溶液和樹脂的顏色變紅或變黑之后，再將其放置于渦旋振蕩儀上振蕩3～4 h，使其充分脫掉多肽上的保護(hù)基并從樹脂上裂解完全。將裂解后的反應(yīng)液緩慢滴入3～5 倍體積冷卻的無水乙醚（0 ℃）中，將沉淀及無水乙醚倒入20 mL 離心管中，用轉(zhuǎn)速2 500 r/min 的離心機(jī)，離心3 min 后，倒掉上層的無水乙醚，下層沉淀再加冰乙醚攪拌洗滌后，再對其離心，重復(fù)上述步驟，最后得到固體的粗肽。裂解沉降得到的粗肽用溶劑（超純水-色譜級乙腈，1∶1）溶解，用0.45 μm 粒徑的水濾膜對其進(jìn)行過濾，得到的濾液用島津反相高效制備液相儀對其進(jìn)行分離純化，流動相A 為超純水溶液，流動相B 為含0.1%三氟醋酸的色譜級乙腈。目標(biāo)物純度經(jīng)HPLC 檢測均高于95%，高分辨質(zhì)譜確定其相對分子質(zhì)量（表1）。

2.2 目標(biāo)化合物對Plk1的抑制活性

Figure 2 Synthetic route of target compound.“R”represents different amino acids or small molecule acids

Table 1 HRMS and purity data of the target compounds

采用熒光偏振法測定目標(biāo)化合物對Plk1 PBD的抑制活性。將FITC-Probe1（60 nmol/L）與Plk1 PBD（300 nmol/L）以及不同濃度的待測試目標(biāo)化合物各20 μL 依次加入384 黑色孔板中，先從高濃度到低濃度加待測試化合物，再從低濃度到高濃度加入Plk1 PBD（300 nmol/L）蛋白溶液，最后從低濃度到高濃度加入FITC-Probe1（60 nmol/L）探針溶液，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。此外，需要加入FITCProbe1（60 nmol/L）標(biāo)簽溶液20 μL，再加緩沖液40 μL作為測試的空白對照，以及含有FITC-Probe1（60 nmol/L）標(biāo)簽溶液20 μL 和Plk1 PBD（300 nmol/L）蛋白溶液20 μL，再加緩沖液20 μL 的混合溶液作為陰性對照，空白對照孔與陰性對照孔都需要設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，空白對照與陰性對照處理方法與每個(gè)化合物的處理方法一致。加完之后室溫避光在臺式搖床上緩慢振搖孵育30 min 后，在熒光偏振儀上進(jìn)行偏振檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過計(jì)算公式計(jì)算出目標(biāo)化合物對Plk1 PBD 的抑制率。抑制率（%）=［1-（陽性對照偏振值- 空白對照偏振值）/（陰性對照偏振值-空白對照偏振值）］×100。再用GraphPad Prism 5 軟件擬合抑制曲線并計(jì)算出目標(biāo)化合物的IC50，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

Table 2 Structures of designed compounds and inhibitory activity to Plk1 PBD(±s,n = 3)

Table 2 Structures of designed compounds and inhibitory activity to Plk1 PBD(±s,n = 3)

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2.3 化合物7l對Plk2、Plk3的抑制活性

化合物對Plk2 PBD 和Plk3 PBD 的抑制活性測試方法與Plk1 PBD 的抑制活性測試方法相同，只需將探針和標(biāo)簽分子換成相應(yīng)的FITC-Probe2和FITC-Probe3即可。

2.4 目標(biāo)化合物對HeLa細(xì)胞增殖的抑制活性

Plk1在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)，因此選擇HeLa細(xì)胞測試化合物對細(xì)胞增殖的抑制活性。將培養(yǎng)的HeLa 細(xì)胞以每孔2 500 個(gè)細(xì)胞加入到96 孔板中，然后加入不同濃度的待測化合物（0，100，200，300，400，500 μmol/L）100 μL，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)孵育24 h 后，每孔加入濃度為5 mg/mL 的3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL。將該懸浮液置于微型振動器上振蕩5 min 后，使用廣譜酶標(biāo)儀測定其在波長為570 nm處的吸收度（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最終結(jié)果取3 次結(jié)果的平均值?；衔飳δ[瘤細(xì)胞增殖抑制率通過下式計(jì)算：抑制率（%）=［（對照組吸收度-給藥組吸收度）/對照組吸收度］×100。

2.5 大鼠血漿穩(wěn)定性測試

將待測化合物與陽性藥配制為100 μg/mL 的溶液，取0.1 mL 加入到新鮮的大鼠血漿1 mL 中，終濃度為10 μg/mL，混合均勻在37 ℃下恒溫孵育。在不同時(shí)間點(diǎn)取孵育的混合溶液100 μL加入到溶劑（甲醇-乙腈，1∶1）300 μL 中，渦旋振蕩后在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min以沉降血漿蛋白。取上清液并用LC-MS 測定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中殘留的化合物含量。

LC-MS 分析是通過Thermo TSQ Quantis LC MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行的，色譜分離使用InertSustain C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A是超純水中含0.1%的甲酸溶液（A 泵），流動相B 是乙腈中含0.1%的甲酸溶液（B泵）。設(shè)定流動相梯度如下：0 min，5%B；8 min，30%B；8.2 min，80%B；9 min，80%B；9.1 min，5%B；15 min，5%B。流速為1 mL/min。所有樣品的進(jìn)樣量為20 μL。正電噴霧電離（ESI）模式用于MS 測定，其源參數(shù)如下：噴霧電壓，4 000 V；傳輸管溫度為350 ℃；鞘氣30 Arb；離子吹掃氣體壓力為1.0 psi（1 psi=6.895 kPa）。

2.6 分子對接研究

Plk1 PBD 蛋白結(jié)構(gòu)從RCSB 的蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得，網(wǎng)址為http：//www. rcsb. org/pdb/home/home.do，晶體結(jié)構(gòu)ID 為3HIK。晶體結(jié)構(gòu)首先用GOLD 5.1 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，添加極性氫以及去除原晶體結(jié)構(gòu)中的配體文件，保存為sdf 格式文件備用。小分子文件采用MOE 2019.01 優(yōu)化，使用MMFF94x 力場進(jìn)行能量優(yōu)化。能量收斂到41.86 J/mol，最大迭代次數(shù)1 000 至優(yōu)化結(jié)束，保存為sdf文件備用。對接采用CCDC GOLD v5.1 軟件中的ChemScore 計(jì)算方法，活性位點(diǎn)定義為以配體分子幾何中心為圓心、半徑為8 ? 的球，遺傳算法參數(shù)（GA）設(shè)置為10，采用ChemScore 打分函數(shù)并設(shè)定選擇所有的對接構(gòu)象，要求計(jì)算結(jié)果RMSD ＜1.5 ?。根據(jù)ChemScore 的打分、氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移的可行性以及化合物與酶形成氫鍵綜合挑選，獲得最優(yōu)對接構(gòu)象。最佳構(gòu)象用MOE 2019.01 做可視化圖象。

3 結(jié)果和討論

由表2可知，以PLHSpT為先導(dǎo)化合物，將結(jié)構(gòu)中的磷酸基團(tuán)替換為羧基，并考察羧基與擬肽骨架之間連接鏈的長度對活性的影響。當(dāng)羧基與骨架之間的距離為2 個(gè)原子（化合物7b）時(shí)，化合物對Plk1 PBD 的抑制活性與先導(dǎo)化合物PLHSpT 相當(dāng)，延長（如化合物7c）或縮短（如化合物7a）均引起活性下降。接下來，將肽鏈中組氨酸的咪唑基團(tuán)用不同的雜環(huán)化合物進(jìn)行替換，也就是將組氨酸殘基用非天然氨基酸殘基進(jìn)行替換，所獲得的化合物均保持了對Plk1 PBD 的抑制活性，選取化合物7i（咪唑環(huán)被噻唑環(huán)替換）進(jìn)行進(jìn)一步的探索。對N-末端的Pro-Leu 基團(tuán)的修飾，參考本課題組前期研究工作［22］，引入了多種非天然的氨基酸取代基，大部分化合物表現(xiàn)出較高的Plk1 PBD 抑制活性，其中化合物7l（N-末端的取代基是4-羥甲基苯甲酰-D-β-天冬氨?；┍憩F(xiàn)出最高的Plk1 PBD 抑制活性（IC50=0.285 μmol/L）?；衔?l的選擇性測試結(jié)果如圖3 所示，其對Plk2 PBD 和Plk3 PBD 的IC50均大于100 μmol/L，表現(xiàn)出顯著的亞型選擇性。

Figure 3 Inhibition of compound 7l to Plk1,Plk2,and Plk3 PBD（±s,n = 3）

先導(dǎo)化合物（PLHSpT，化合物1）在500 μmol/L下對HeLa 細(xì)胞增殖沒有抑制作用，酶水平的抑制活性和腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性之間的巨大差別由于磷酸肽對細(xì)胞膜較差的滲透性所導(dǎo)致［17］?；衔?l 對HeLa 細(xì)胞增殖的IC50為362 μmol/L（圖4）。雖然化合物1 對Plk1 PBD 的抑制活性與化合物7l相當(dāng)，但是對腫瘤細(xì)胞增殖的作用卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化合物7l。這說明對擬肽化合物結(jié)構(gòu)改造提高了化合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。

Figure 4 In vitro cell toxicity of compound 7l on HeLa cells after 24 h incubation（±s,n = 3）

化合物的大鼠血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到30 min 或者更久時(shí)，化合物7l的降解速度明顯慢于陽性對照（PLHSpT，化合物1）。孵育到120 min 時(shí)，血漿中陽性對照PLHSpT的殘留量為43.3%，而相比之下，化合物7l 的剩余量仍超過70%。PLHSpT 結(jié)構(gòu)中全部是天然氨基酸，而改造得到的化合物7l 的結(jié)構(gòu)中僅含有兩個(gè)天然氨基酸殘基，這樣的非天然氨基酸修飾增加了擬肽化合物的血漿穩(wěn)定性。

Figure 5 Plasma stability of PLHSpT (1) and compound 7l（±s,n = 3）

選取活性最好的化合物7l，將其進(jìn)行對接研究，對接結(jié)果見圖6。從分子對接圖中可以看出，化合物7l 上C 端的羧基可以進(jìn)入磷酸基結(jié)合口袋與Plk1 PBD 上的Lys540 產(chǎn)生靜電相互作用，這與PLHSpT 類似。絲氨酸殘基上的羰基和氨基與Trp414上的氨基與羰基產(chǎn)生氫鍵相互作用，β-D-天冬氨酸側(cè)鏈的羧基與Plk1 PBD上的Arg516的胍基產(chǎn)生靜電相互作用，這個(gè)作用力的增加可能是化合物7l 結(jié)構(gòu)中雖然缺少了磷酸基這樣強(qiáng)作用的基團(tuán)卻仍然能保持活性的主要原因。

Figure 6 Docking study on compound 7l with Plk1 PBD(A). Binding modes of compound 7l (yellow) and the co-crystallized ligand PLHSpT(cyan)(B), where consistent binding modes were found between compound 7l and PLHSpT in the crystal structure(PDB code 3HIK)

4 結(jié) 論

通過將磷酸肽結(jié)構(gòu)的Plk1 PBD 抑制劑的磷酸基用羧基替換，并且將肽鏈中用各種非天然氨基酸進(jìn)行改造和修飾，本研究獲得了一系列不含磷酸基團(tuán)的選擇性Plk1 PBD 抑制劑。大部分化合物表現(xiàn)出對Plk1 PBD 的中等抑制活性，其中化合物7l 對Plk1 PBD 抑制活性與先導(dǎo)化合物PLHSpT 相當(dāng)，且具有高選擇性。與磷酸肽類結(jié)構(gòu)化合物相比，改造后的化合物具有更好的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用。并且，經(jīng)過非天然氨基酸修飾和改造，化合物的血漿穩(wěn)定性得到了提高。這類不含磷酸基團(tuán)的擬肽類化合物的發(fā)現(xiàn)，為尋找新型的選擇性Plk1 PBD抑制劑提供了參考。