劉琳娜 丁士剛 賈淑娟

北京大學(xué)首鋼醫(yī)院消化科1(100144) 北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科2

背景：長(zhǎng)期服用阿司匹林可造成不同程度的胃黏膜損傷。鋁碳酸鎂可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)胃黏膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用。目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討鋁碳酸鎂對(duì)阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法：選取人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，設(shè)置正常對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組，后兩組加入阿司匹林9 mmol/L共培養(yǎng)，保護(hù)組進(jìn)一步予0.6 mg/mL鋁碳酸鎂干預(yù)。培養(yǎng)12 h后，使用倒置生物顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活和凋亡情況，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選、鑒定損傷組與保護(hù)組差異表達(dá)蛋白。結(jié)果：與損傷組相比，保護(hù)組GES-1細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，細(xì)胞存活率高、凋亡率低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);T復(fù)合蛋白1β亞基(TCP-1β)和硫氧還蛋白依賴性過(guò)氧化物還原酶3(PRX3)表達(dá)上調(diào)，兩種蛋白分別與蛋白質(zhì)的折疊和組裝、細(xì)胞骨架功能以及抗氧化應(yīng)激有關(guān)。結(jié)論：鋁碳酸鎂可通過(guò)促增殖、抗凋亡減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷，其機(jī)制可能與改善細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。

低劑量阿司匹林廣泛應(yīng)用于心腦血管事件的預(yù)防。然而，長(zhǎng)期服用阿司匹林會(huì)增加患者的胃腸道疾病風(fēng)險(xiǎn)，如消化不良、消化性潰瘍出血甚至因大出血致死。阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷可誘發(fā)潰瘍和出血[1-2]，然而，由于阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，潰瘍患者的腹痛癥狀往往不明顯，從而延誤診治，對(duì)此類人群應(yīng)予足夠的重視。鋁碳酸鎂是一種具有層狀網(wǎng)絡(luò)晶格結(jié)構(gòu)的藥物，能通過(guò)中和胃酸、加強(qiáng)胃黏膜屏障功能、阻斷損傷因子而有效保護(hù)胃黏膜[3-7]。本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討鋁碳酸鎂對(duì)阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；阿司匹林(純度≥ 99%)、PI(Sigma-Aldrich?, Merck KGaA)；鋁碳酸鎂(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

WMS-3680研究級(jí)倒置生物顯微鏡(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司)；JEM-1400Plus 透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)；電泳儀(Bio-Rad Laboratories, Inc.)；DuoScan T1200掃描機(jī)(Agfa-Gevaert Group)；冷凍高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理：GES-1 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)箱中，每周換液3次，細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，1∶3傳代。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)組別：正常對(duì)照組細(xì)胞不予任何處理；阿司匹林損傷組(簡(jiǎn)稱損傷組)加入阿司匹林9 mmol/L共培養(yǎng)；鋁碳酸鎂保護(hù)組(簡(jiǎn)稱保護(hù)組)在阿司匹林處理的基礎(chǔ)上予0.6 mg/mL鋁碳酸鎂干預(yù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：各組GES-1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，倒置生物顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。收集各組細(xì)胞，離心、固定，環(huán)氧樹脂包埋，乙酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，超薄切片機(jī)切片，透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

3. MTT實(shí)驗(yàn)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GES-1細(xì)胞，以每孔0.5×104加入96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，按前述方法分組和處理。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，每孔加入200 μL MTT，4 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩10 min溶解，使用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

4. 流式細(xì)胞分析：各組GES-1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，PBS 洗滌3 次，將細(xì)胞重懸于1 mL PI染液中，30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。

5. 雙向凝膠電泳：各組GES-1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。①等電聚焦：使用17 cm線性膠條，上樣量為每膠120 μg，轉(zhuǎn)至濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠。②電泳：每膠10 mA，30 min；每30 mA，5 h。銀染后掃描，ImageMaster 5.0 2D膠分析軟件結(jié)合手工操作進(jìn)行分析，得到差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。切取蛋白質(zhì)點(diǎn)以胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，檢索Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com/)確定蛋白質(zhì)名稱和功能。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

倒置生物顯微鏡下，正常對(duì)照組GES-1細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型，細(xì)胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好，均一貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)基清亮；損傷組和保護(hù)組貼壁細(xì)胞數(shù)量均減少，與保護(hù)組相比，損傷組懸浮細(xì)胞增多，部分細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞質(zhì)萎縮(圖1)。

A：正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好；B：損傷組懸浮細(xì)胞增多，貼壁細(xì)胞減少；C：保護(hù)組可見(jiàn)懸浮細(xì)胞，但數(shù)量明顯少于損傷組

透射電子顯微鏡下，正常對(duì)照組GES-1細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，胞核位于細(xì)胞中央，核膜完整，線粒體等細(xì)胞器分布于胞質(zhì)中；損傷組細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性，胞膜和核膜有不同程度的缺損，胞質(zhì)中細(xì)胞器減少，細(xì)胞呈現(xiàn)壞死狀態(tài)；保護(hù)組胞核呈現(xiàn)不規(guī)則的多樣性，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整性(圖2)。

A：正常對(duì)照組細(xì)胞胞核位于細(xì)胞中央，核膜完整；B：損傷組細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性，胞膜和核膜缺損，細(xì)胞器減少，呈現(xiàn)壞死狀態(tài)；C：保護(hù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整性

二、細(xì)胞存活和凋亡情況

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，損傷組和保護(hù)組GES-1細(xì)胞存活率分別為19%和46%，保護(hù)組明顯高于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

流式細(xì)胞分析顯示，損傷組和保護(hù)組GES-1細(xì)胞凋亡率分別為30.6%和15.3%，保護(hù)組明顯低于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3)。

圖3 損傷組和保護(hù)組GES-1細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞分析圖

三、差異表達(dá)蛋白篩選和鑒定

蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，與損傷組相比，保護(hù)組有2種蛋白表達(dá)上調(diào)，名稱分別為T復(fù)合蛋白1 β亞基(T-complex protein 1 subunit beta, TCP-1β)和硫氧還蛋白依賴性過(guò)氧化物還原酶3(thioredoxin-dependent peroxide reductase 3, PRX3；圖4)，功能分別為減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)和保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。

1: TCP-1β;2: PRX3

討 論

阿司匹林是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，長(zhǎng)期服用可造成不同程度的胃黏膜損傷，引起潰瘍和出血[1-2]。既往研究顯示，阿司匹林對(duì)胃黏膜細(xì)胞的損傷作用與抑制生長(zhǎng)因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(PDGF-AB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)，氧化應(yīng)激在阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷中也發(fā)揮重要作用[2，8-10]。有研究[10]顯示，阿司匹林可能通過(guò)抑制Nrf2/HO-1抗氧化通路上調(diào)胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞活力。

鋁碳酸鎂是一類具有抗酸和胃黏膜保護(hù)作用的非處方藥，可通過(guò)中和胃酸、抑制胃蛋白酶活性、增加前列腺素E2合成、促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子釋放、結(jié)合膽汁酸等多種藥理學(xué)作用保護(hù)胃黏膜、減少損傷和破壞胃黏膜的因素、促進(jìn)潰瘍面修復(fù)，不良反應(yīng)少而輕微[3-7]。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)阿司匹林處理的人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性；予鋁碳酸鎂干預(yù)的GES-1細(xì)胞則能保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，與損傷組相比，細(xì)胞存活率增高，凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選損傷組與保護(hù)組的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)保護(hù)組TCP-1β和PRX3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。TCP-1β是一種伴侶蛋白，又稱含TCP1伴侶蛋白亞基2(chaperonin containing TCP1, subunit 2, CCT2)，在真核細(xì)胞中主要參與協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，在DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架功能、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮重要生理作用[11-12]。研究表明CCTs可通過(guò)調(diào)節(jié)微管蛋白、肌動(dòng)蛋白等，在腸道細(xì)胞微絨毛形成以及細(xì)胞的存活、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[13-14]。本研究中保護(hù)組GES-1細(xì)胞高表達(dá)TCP-1β，提示其可能參與了鋁碳酸鎂的細(xì)胞保護(hù)作用。鋁碳酸鎂可能通過(guò)上調(diào)TCP-1β表達(dá)影響胃黏膜上皮細(xì)胞中的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活，減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷。PRX3定位于線粒體，具有強(qiáng)力抗氧化作用，可清除ROS，維持線粒體膜穩(wěn)定性，保護(hù)對(duì)自由基敏感的酶類抵抗氧化應(yīng)激損傷，并參與調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)激活，在線粒體抗氧化防御機(jī)制中起至關(guān)重要的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)保護(hù)組GES-1細(xì)胞高表達(dá)PRX3，提示增強(qiáng)胃黏膜上皮細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制、維持線粒體穩(wěn)定可能是鋁碳酸鎂對(duì)阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述，鋁碳酸鎂可通過(guò)促增殖、抗凋亡減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷，其機(jī)制可能與改善細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。然而，本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行了初步探討，后續(xù)擬建立阿司匹林急性胃黏膜損傷動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)變化驗(yàn)證鋁碳酸鎂的細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)TCP-1β和PRX3所涉及的信號(hào)通路作進(jìn)一步研究。