姜曉旭 ，李曉嶼 ，馬 瑤 ，Ralf Müller-Xing *，邢 倩 *

（1.東北林業(yè)大學(xué)/東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040； 3.遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001）

擬南芥蛋白CLF是果蠅PRC2組分Zeste[E（z）]的直系同源物，這是一種對H3K27具有特異性的甲基轉(zhuǎn)移酶。最初在黑腹果蠅中被發(fā)現(xiàn)，不久后在擬南芥中發(fā)現(xiàn)E（z）的同源蛋白，其組分之一為CLF[1]。通過對擬南芥clf突變體展開研究，發(fā)現(xiàn)CLF在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。它的缺失能夠改變植物的花期，花朵形態(tài)，造成葉子多效性等[2]。近年來隨著對PRC2的深入研究，CLF的面貌也逐漸清晰完整起來。本文主要介紹了CLF的表達(dá)模式，通過調(diào)控其下游基因的表達(dá)來參與植物各個(gè)器官，如花，果實(shí)，葉片等的形態(tài)建成，以期為研究CLF及CLF同源物在植物形態(tài)建成和生長發(fā)育過程中的功能提供參考。

1 CLF影響植物花發(fā)育及花期

1.1 CLF影響植物花發(fā)育

短日照下clf突變體與野生型植物的花形態(tài)差別明顯[1，3]。clf-2（CLF缺失型突變體）開花后伸長的莖間和節(jié)間較野生型植株短，花序高度較野生型花序高度低。野生型花朵的萼片在花發(fā)育后期能夠包裹住花苞，但clf-2突變體的萼片卻少有彎曲，不能完全包裹花苞，所以導(dǎo)致花苞提前開放[1]。同野生型相比，clf突變體的花瓣總是更小更窄。突變體的花表現(xiàn)出萼片和花瓣分別向心皮和雄蕊的部分同源轉(zhuǎn)變。雄蕊樣花瓣形狀介于花瓣與雄蕊之間，白色花瓣表面有黃色花藥樣組織斑塊。在受影響最嚴(yán)重的花中，第二輪花器官有缺失。心皮樣萼片具有心皮特有的幾個(gè)特征，例如萼片常沿邊緣融合，頂端有類似乳頭狀突起，邊緣產(chǎn)生胚珠[1]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些花朵其雄蕊數(shù)量減少，心皮也未完全融合。而在長日照的條件下，clf與野生型花朵的形態(tài)差別不明顯。所以CLF缺失后，對短日照條件下的花朵發(fā)育有較大的影響。

1.2 CLF調(diào)控開花基因

clf-50是一種缺失型突變體，其開花時(shí)間較野生型早。以蓮座葉和莖生葉的葉片總數(shù)作為衡量植物開花時(shí)間長短的標(biāo)準(zhǔn)。在長日照中，clf-50突變體的葉片總數(shù)比野生型少10片左右，在短日照中，clf-50突變體的葉片總數(shù)比野生型少20片左右[4]。

在clf突變體植物中，不只發(fā)現(xiàn)AG（AGAMOUS）異位表達(dá)。與開花相關(guān)的基因FT（FLOWERING LOCUS T），F(xiàn)LC（FLOWERING LOCUS C）也同樣異位表達(dá)[5]。AP3（APETALA3），SEP3（SEPALLATA3）在clf突變體中亦大量表達(dá)[6，7]。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在開花過渡期間，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶CLF可以與NF-YC（Nuclear Factor-Y subunit C）同源物質(zhì)短暫互作[8]。在植物中，NF-YC亞基由一個(gè)多基因家族編碼，在控制開花時(shí)間上起重要作用[9，10]。擬南芥NF-YC同源基因在光周期依賴性開花途徑中與FT基因具有功能上的冗余性，它們通過形成典型的NF-YC-YB-YA和特定的NF-YC-YB-CO復(fù)合物，分別在FT啟動(dòng)子區(qū)域識別遠(yuǎn)端CCAAT盒增強(qiáng)子和近端共反應(yīng)元件[11，12]。NF-Y因子通過招募不同的組蛋白修飾因子來調(diào)控不同階段的植物發(fā)育[13]。NF-YC同源物通過與CLF的短暫相互作用來抵消H3K27三甲基化在FT染色質(zhì)中的沉積，從而減弱CLF與FT位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)，在長日照條件下解除對FT轉(zhuǎn)錄的抑制[8]。FT基因的表達(dá)能夠促進(jìn)植物開花，當(dāng)FT位點(diǎn)上三甲基化標(biāo)記減少后，植物就會(huì)提前開花。

在二穗短柄草中，EZL1（ENHANCER OF ZESTE-LIKE 1）是擬南芥CLF的同源基因[14]。ezl1功能缺失突變體在長日照下表現(xiàn)出不經(jīng)過春化就能提前開花的表型，與擬南芥clf突變體表現(xiàn)相同。并且與開花相關(guān)的基因VRN1和AG的表達(dá)量都有升高，植物整體H3K27的二甲基化水平和三甲基化水平明顯降低。在ezl1突變體的基礎(chǔ)上突變VRN1或AG，早花的表型會(huì)得到部分恢復(fù)[15]。所以CLF和CLF同源基因在調(diào)控植物開花時(shí)間上起到了十分重要的作用。

2 CLF影響植物種子及果實(shí)發(fā)育

2.1 CLF影響種子發(fā)育

通過對轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中約11.6%的基因在各個(gè)器官中被CLF抑制。令人意外的是，其中大約54%的基因在莢果中最先被抑制。對118個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步分析揭示了一組CLF在成熟-青綠期胚胎中優(yōu)先表達(dá)和抑制的基因，這一觀察結(jié)果表明，CLF在胚胎發(fā)育期間介導(dǎo)了大規(guī)模的H3K27三甲基化標(biāo)記或者重新標(biāo)記事件[16]。有研究表明，在莢果中被CLF抑制的基因除能夠響應(yīng)激素外，還能夠編碼與脂質(zhì)顆粒，脂質(zhì)儲存和種子成熟相關(guān)的蛋白。同野生型相比，clf突變體中調(diào)控種子發(fā)育的ABI3（ABA INSENSITIVE3）和FUS3（FUSCA3）基因的表達(dá)量升高，所以clf-28（CLF缺失突變體植株）的種子形狀更大，質(zhì)量更重，含油量也更高[16，17]。這也證明在莢果中CLF參與調(diào)控與種子合成相關(guān)的基因。

2.2 CLF影響果實(shí)發(fā)育

CLF同源基因能夠調(diào)控番茄的果實(shí)發(fā)育。擬南芥一個(gè)小基因家族編碼的Zeste Polycomb group蛋白在番茄中由三個(gè)基因SlEZ1、SlEZ2和SlEZ3編碼[18]。番茄基因組只含有一個(gè)ESC和一個(gè)Su(z)12，但是含有三個(gè)E（z）基因，其中的兩個(gè)基因，SlEZ1和SlEZ2，分別與擬南芥SWINGER和CURLY LEAF基因同源，編碼針對細(xì)胞核的蛋白質(zhì)，而第三個(gè)基因，SlEZ3，被認(rèn)為是編碼一個(gè)缺乏定義域的截?cái)嗟鞍譡18]。對SlEZ1基因的功能分析表明，該蛋白與番茄花心皮數(shù)和雄蕊發(fā)育有關(guān)[19]。與擬南芥中CLF同源性最高的SlEZ2缺失后，番茄中H3K27三甲基化水平明顯降低，這點(diǎn)與擬南芥缺失CLF后表現(xiàn)相同。SlEZ2在大多數(shù)植物器官中均有表達(dá)，但在葉片、花瓣和花柱中的細(xì)胞中有特異性表達(dá)。在slez2轉(zhuǎn)基因突變體中，花敗育的幾率增加，番茄成熟的果實(shí)也要比野生型的球形果實(shí)更加扁平且柔軟[18]。在相同年齡下，slez2轉(zhuǎn)基因的果實(shí)顏色不表現(xiàn)出健康的綠色，而呈淡綠色至慘白色，果實(shí)上有一些不規(guī)則的綠點(diǎn)。而野生植物的果實(shí)大部分呈現(xiàn)出健康的綠色，一些果實(shí)上還有若干條規(guī)則的淡黃色條紋[18]。果實(shí)成熟后，野生型和轉(zhuǎn)基因植物的成熟果實(shí)大多為紅色，但轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)紅色強(qiáng)度往往低于野生型，與轉(zhuǎn)基因果實(shí)中番茄紅素含量降低相一致。所以CLF同源基因在調(diào)控植物果實(shí)發(fā)育及成熟上起著十分重要的作用。

3 CLF影響植物葉片發(fā)育

細(xì)胞在每一階段的分裂和伸長速率影響植物葉片最終形狀的形成[20-22]。CLF突變后，擬南芥表現(xiàn)出既窄又小向上卷曲的葉片[1]。并且葉片的伸長程度明顯下降[23]。CLF能對開花同源基因AG進(jìn)行調(diào)控，clf突變體呈現(xiàn)出窄，小，并葉卷的表型與AG基因過表達(dá)的表型十分相似[24，25]，而造成葉片這種表型正是因?yàn)殚_花同源基因AG的異位表達(dá)[1，4]，在clf-50的背景下再次突變AG基因后會(huì)發(fā)現(xiàn)，clf-50 ag雙突變體葉片平展，葉片表型恢復(fù)[4]，和野生型葉片表型相似。

clf突變體植物的葉片細(xì)胞不論是從數(shù)量還是大小上都有著明顯的下調(diào)[23]。在橫切面上clf-25（CLF功能缺失突變體）的柵欄細(xì)胞寬度是完全展開的第五片葉的59%，在縱向切片上，clf-25突變體的柵欄細(xì)胞長度和厚度分別為同時(shí)期野生型的59%和65%[23]。clf-25突變體葉片柵欄細(xì)胞數(shù)量分別為野生型葉片寬度方向細(xì)胞數(shù)量的55%和葉長方向細(xì)胞數(shù)量的67%。clf-25突變體的葉片細(xì)胞總數(shù)也遠(yuǎn)少于野生型葉片細(xì)胞總數(shù)[23]。同野生型相比，clf突變體在葉片發(fā)育過程中細(xì)胞分裂期和細(xì)胞伸長期的時(shí)間雖沒有明顯變化，但clf突變體的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞伸長率都明顯低于野生型[23]。有實(shí)驗(yàn)表明，clf突變體的葉片的細(xì)胞數(shù)量顯著減少[23]。由此可知clf突變體植物的葉片能夠正常形成，但是葉片的大小和數(shù)量卻顯著降低。

4 CLF影響植物根及側(cè)枝生長

生長素的極性運(yùn)輸影響植物根的生長和發(fā)育。擬南芥中的生成細(xì)胞需要IAA28（吲哚-3-乙酸-28）依賴的生長素信號才能開始分裂[26]。在擬南芥中，PIN（PIN-FORMED）家族是生長素運(yùn)輸載體，定位在質(zhì)膜上。其中PIN1在中柱基底膜定位并將生長素運(yùn)輸?shù)礁鈁27，28]。在擬南芥根尖，緩慢分裂的靜止中心和周圍的干細(xì)胞構(gòu)成了根干細(xì)胞生態(tài)位（Stem Cell Niche，SCN）[29]。而CLF甲基轉(zhuǎn)移酶可以抑制原根中干細(xì)胞的活性[30]，抑制細(xì)胞的分裂從而能在一定時(shí)間內(nèi)限制根的伸長，所以當(dāng)CLF缺失后，突變體的主根長度和側(cè)根數(shù)量都會(huì)較野生型有明顯變化。

有研究表明，clf-81植株（CLF功能缺失突變體）同野生型相比，其主根的長度會(huì)比野生型主根更長，側(cè)根數(shù)量和密集程度也較野生型增加，而clf-59（CLF過表達(dá)突變體）植株同野生型相比，主根長度顯著縮短，側(cè)根數(shù)量也較野生型有大量減少[29]。arf-7和arf-19（生長素響應(yīng)因子AUXIN RESPONSE FACTOR,ARF功能缺失突變體）無側(cè)根生成，clf-81、arf-7、arf-19三突變體亦沒有側(cè)根生成。這說明，CLF可在上游調(diào)控ARF7，ARF19來抑制側(cè)根生成。用生長素響應(yīng)基因DR5沿主根標(biāo)記生成細(xì)胞，clf-81植株的能夠被標(biāo)記的靜態(tài)點(diǎn)同野生型相比有顯著增加[31，32]，這暗示CLF能抑制生成細(xì)胞的產(chǎn)生。并且在clf-1（CLF缺失突變體），clf-81植株中，PIN1的表達(dá)量有明顯的上調(diào)，證明CLF能夠直接抑制PIN1的表達(dá)。在clf-29突變體中，NRT2.1（NITRATE TRANSPORTER 2.1）的表達(dá)量也顯著升高，NRT2.1能夠編碼擬南芥中的關(guān)鍵根硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而抑制側(cè)根起始物的生成[33]。還有研究表明，clf-28（CLF缺失突變體）的側(cè)枝同野生型相比明顯增多[34]。所以CLF能通過調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)來影響根的伸長和側(cè)根的形成。附圖為CLF參與植物部分器官形態(tài)建成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

附圖 CLF參與植物器官形態(tài)建成

5 CLF對植物生長發(fā)育的其他影響

除了本文上述所討論的基因外，還有許多其他基因也受到CLF的調(diào)控。在野生型擬南芥中，至少有6 854個(gè)以上的基因位點(diǎn)是H3K27三甲基化的富集區(qū)域，這些靶基因受到PRC2蛋白調(diào)控，往往具有時(shí)空表達(dá)特異性[35]。如I類KNOX（KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX）基因，它能夠在胚胎發(fā)生和整個(gè)成熟發(fā)育過程中在莖頂端分生組織中起作用，維持細(xì)胞分裂不分化的狀態(tài)[36，37]。DOG1（DELAYOF GERMINATION1）據(jù)報(bào)道是種子休眠的主要調(diào)節(jié)基因，它的缺失會(huì)形成不休眠種子[38-40]。DOG1在種子休眠前成熟過程中表達(dá)，其積累與休眠水平相關(guān)。低溫也會(huì)上調(diào)DOG1的表達(dá)從而抑制休眠被打破[39]。而CLF表達(dá)會(huì)增加DOG1位點(diǎn)上H3K27三甲基化沉積，負(fù)調(diào)控DOG1，打破休眠并誘導(dǎo)萌發(fā)[41]。由CLF和SWN控制的H3K27三甲基化在植物脫落酸誘導(dǎo)的響應(yīng)元件上富集，有助于長期抑制ABA誘導(dǎo)的衰老，并潛在地加強(qiáng)了植物的脅迫耐受性[42]。FIT（FER-LIKE IRON DEFICIENCY INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR）推測是鐵元素?cái)z取反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，CLF突變后，F(xiàn)IT表達(dá)量升高，研究發(fā)現(xiàn)clf突變體比野生型更耐鐵缺乏[43]。AGO1（ARGONAUTE1）可以選擇性招募micro RNA和siRNA并切碎他們。CLF突變后，由于AGO1泛素化增加導(dǎo)致特定組織的miRNA活性因此受損[44]。由此可知，CLF在植物整個(gè)生長發(fā)育和形態(tài)建成中起到了十分重要的作用。附表為CLF參與調(diào)控的基因。

附表 CLF參與調(diào)控的基因

6 結(jié)語

自1997年發(fā)現(xiàn)CLF以來，對于CLF的相關(guān)研究已取得很大成果?，F(xiàn)在國內(nèi)對于CLF的研究主要與PRC2相關(guān)，對其基因本身的探究相對較少。主要分析CLF具有的H3K27的三甲基化的抑制作用。而國外學(xué)者對于CLF研究在于它在生物形態(tài)建成方面時(shí)發(fā)揮的功能，探究生物在生長過程中CLF與上下游基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。在形態(tài)建成方面，CLF涉及植物生長發(fā)育的方方面面，包括到根的伸長，種子發(fā)育，葉片生長及花發(fā)育。但是，CLF基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用現(xiàn)在還處于繼續(xù)探究并完善的階段。

此外，CLF蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，在番茄，大米，二穗短柄草等其他植物中亦發(fā)現(xiàn)其同源物質(zhì)。因此我們對這個(gè)基因的研究不應(yīng)只停留在模式作物中。在水稻，番茄等農(nóng)作物上，關(guān)于CLF的研究相對較少，而有實(shí)驗(yàn)表明CLF對于植物果實(shí)的成熟有著很重要的調(diào)控作用，所以研究CLF對于經(jīng)濟(jì)作物的增產(chǎn)方面會(huì)具有重要意義。不僅如此，在觀賞性植物中，CLF也為促進(jìn)新品種的產(chǎn)生和提升觀賞性提供了更多可能。